AbMole|局部氢气释放重塑衰老微环境促进受伤骨骼修复的实验研究

---

 随着人口老龄化的加剧，衰老相关疾病的治疗成为了医学界关注的焦点。骨骼衰老和损伤后的修复困难是老年人面临的重要问题之一。

来自中国科学院深圳先进技术研究院神经工程研究中心的Shengqiang Chen, Yuanman Yu, Songqing Xie等多名研究人员发表了题为《Local H2 release remodels senescence microenvironment for improved repair of injured bone》的研究成果，文章探讨局部氢气（H₂）释放对衰老骨骼微环境的重塑作用及其对受伤骨骼修复的影响。

在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的ruxolitinib（目录号M1787）、quercetin（目录号M3902）、dasatinib（M1701）。

细胞分离与培养：从 24 个月大的衰老小鼠（相当于 70 岁的人）的骨骼中分离出骨髓间充质干细胞（BMSCs）、巨噬细胞和骨细胞，并进行鉴定和培养。

持续 H₂供应的体外实验：将分离出的细胞在 60% 氢气培养箱中连续孵育 7 天，模拟体外持续 H₂供应微环境，检测代表性衰老生物标志物（ROS、HO - 1、p16、p21、Ki67、γ - H2A.X、TAFs、SA - β - gal、IL - 6 和 IL - 1β）的表达，评估 H₂对细胞衰老和炎症的影响。    

图 1：可持续 H 的体外抗炎和抗衰老行为2治疗衰老骨骼中的各种衰老细胞。

持续 H₂释放支架的构建与表征：合成聚羟基链烷酸酯（PHA）包裹的 CaSi₂纳米颗粒（CSN），并将其负载到介孔生物活性玻璃（MBG）支架上（CSN@PHA - MBG），通过电喷雾法制备出具有高 H₂负载和持续 H₂释放能力的支架。    

图 2：CSN 和 CSN@PHA-MBG 支架的结构和氢释放行为。

体内实验：建立老年小鼠（24 个月大）临界尺寸股骨塞缺损模型（直径 1.2mm 的圆形缺损），评估 CSN@PHA - MBG 支架在体内的氢释放行为、对局部炎症的影响以及对衰老和免疫调节的作用。

抗炎症和抗衰老作用：与从年轻骨骼中采集的细胞相比，衰老骨骼中的细胞表现出明显的衰老特征，包括细胞内 ROS、p16、p21 和 SA - β - gal 的过度表达，以及 HO - 1 和 Ki67 的低表达。γ - H2A.X 焦点与 TAFs 共定位。连续 7 天的 H₂处理显著下调了所有这些衰老生物标志物的表达，进一步促进了 HO - 1 活性和 Ki67 表达，表明 H₂具有强大的普遍抗衰作用。

对 SASP 成分的影响：H₂降低了所有研究类型细胞中 IL - 6 和 IL - 1β 的水平，特别是在第 3 天和第 7 天显著下调了 IL - 6 的表达，在 BMSCs 和巨噬细胞中显著降低了 IL - 1β 的表达。    

图 3：支架处理 7 天后衰老骨缺损部位的 SASP 成分分析。

对巨噬细胞极化的作用：H₂在 7 天的处理过程中将巨噬细胞从 M1 表型（CD86 和 iNOS）极化为 M2 表型（CD206、Arg1 和 Il - 10），TNF - α 水平与 TGF - β1 水平的比值显著下降，表明 H₂诱导了巨噬细胞从促炎亚型向抗炎亚型的转变。

对 BMSCs 再生潜力的影响：H₂处理显著阻止了 BMSCs 衰老的进展，减少了 SA - β - gal 阳性细胞的数量，降低了衰老相关基因（p16、p21 和 p53）的表达，同时抑制了衰老细胞对破骨细胞生成的影响，保存了 BMSCs 的成骨分化潜力，表现为成骨相关基因（Runx2、Osterix、Alp、Opn、Col.I 和 Ocn）的表达增强和矿化程度的提高。    

图 4：CSN@PHA-MBG 支架对受伤衰老骨骼中 BMSC 募集和衰老的影响。

CSN 的合成与表征：通过微波辅助化学剥离法合成了 CSN，其尺寸约为 500nm，化学剥离未改变 CaSi₂的化学组成和晶体结构，CSN 在 pH = 7.4 的 PBS 中能水解释放大量 H₂，但会在一天内完全降解。

CSN@PHA - MBG 支架的制备与表征：通过将 PHA 包裹的 CSN 沉积在 MBG 底物的多孔表面上，制备出 CSN@PHA - MBG 支架。该支架具有持续的 H₂释放特性，释放时间长达 7 天，且具有高细胞相容性。CSN@PHA - MBG 支架能显著降低 BMSCs 中 SA - β - gal 的表达，其最低有效 CSN 含量（或氢剂量）约为 70μg/g。    

局部持续氢释放对衰老骨骼微环境和巨噬细胞极化的影响：CSN@PHA - MBG 支架在体内的氢释放时间长达 9 天，比在 PBS 中更长。在植入后的第 3 天和第 7 天，植入部位出现了强烈的绿色荧光（F4/80 标记的巨噬细胞），表明存在炎症现象。与对照组和 PHA - MBG 载体组相比，CSN@PHA - MBG 支架具有强大的抗炎作用，表现为 iNOS 表达降低（M1 巨噬细胞表型的生物标志物）、ARG1 水平升高（M2 巨噬细胞表型的生物标志物）和纤维化减少。p16 阳性细胞的比例随着时间的推移而增加，显示出衰老的旁观者效应，但 CSN@PHA - MBG 显著且稳定地减轻了衰老 / 损伤叠加衰老的进展。巨噬细胞中 p16 阳性表型较高，H₂持续释放至 7 天在防止巨噬细胞衰老和介导免疫反应中发挥了重要作用。CSN@PHA - MBG 更显著且稳定地降低了 M1 表型和 M2 表型巨噬细胞数量的比例，在第 7 天诱导了高比例的 M2 表型巨噬细胞浸润（约 40%），表明微环境从促炎向抗炎的有效转变，有利于衰老骨骼微环境的重塑和损伤修复。

氢释放支架对衰老骨骼缺损部位促再生微环境的影响：与对照组和 PHA - MBG 组相比，CSN@PHA - MBG 组中富集的 BMSCs 比例更高，p16 表达显著降低，衰老 BMSCs 的比例最低。同时，CSN@PHA - MBG 支架显著增加了骨祖细胞和 H 型内皮细胞的数量，促进了血管网络的形成，为 BMSCs 的招募和抗衰提供了有利的生态位，支持血管生成和骨生成，促进衰老骨骼缺损的再生。    

氢释放支架对受伤衰老骨骼修复结果的影响：通过对新形成组织的骨形成率、组织形态、衰老细胞负担和抗破骨细胞生成潜力的综合分析，发现 CSN@PHA - MBG 支架显著增强了骨沉积速率，组织学检查显示出更快的骨形成和更多的新骨生成。在治疗结束时（第 28 天），CSN@PHA - MBG 组的骨体积 / 总体积比（BV/TV）更高，骨小梁数量（Tb.N）更多，骨小梁厚度（Tb.Th）更大，且衰老细胞（p16⁺）明显减少，抗破骨细胞生成作用明显，Vpp3 表达阳性的细胞减少。这些结果表明，CSN@PHA - MBG 支架通过有效的微环境重塑，在抑制破骨细胞生成方面发挥了主要作用，从而改善了衰老骨骼缺损的修复结果。

本文揭示了局部 H₂释放通过衰老巨噬细胞的复极化和分泌组变化改变微环境，从促炎转变为抗炎，减轻衰老 / 损伤叠加衰老的进展，促进内源性细胞的招募并保存其再生能力，从而创造支持骨缺损再生的促再生微环境。CSN@PHA - MBG 支架能够实现局部和持续的高剂量 H₂供应，为促进受伤衰老骨骼的再生提供了一种有前途的抗衰方法。未来的研究可以进一步探索 H₂作用的具体机制，以及开发具有更高持续释放能力的 H₂前药 / 支架，以提高骨骼再生的效果。