1. 什么是单细胞转录组测序（scRNA-seq）？
单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种高通量测序技术，可以在单细胞水平解析基因表达情况，揭示细胞异质性，探索稀有细胞类型，并研究细胞状态转换及动态调控机制。
与传统的bulk RNA-seq（群体RNA测序）相比，scRNA-seq的优势在于能够解析细胞间的差异，避免群体平均效应的影响，从而更精准地分析复杂生物体系。
2. 单细胞转录组测序的应用
scRNA-seq 在多个生物学和医学领域都有重要应用，包括但不限于：
- 细胞类型鉴定
：解析组织或器官中的不同细胞亚群
- 细胞命运轨迹推断
：研究细胞发育过程及分化轨迹
- 肿瘤异质性分析
：揭示肿瘤微环境和耐药机制
- 免疫学研究
：探索免疫细胞亚型及其功能
- 神经科学
：分析神经元和胶质细胞的异质性
- 干细胞研究
：研究干细胞分化及再生机制
3. scRNA-seq 实验流程
scRNA-seq的实验流程主要包括单细胞分离、cDNA合成及扩增、文库构建、高通量测序等步骤。
（1）单细胞分离
目前常用的单细胞分离技术包括：
- 微流体芯片（如 10x Genomics）
：基于液滴分离单细胞，常用于大规模单细胞研究
- 荧光激活细胞分选（FACS）
：利用荧光标记和流式细胞仪筛选单细胞
- 激光捕获显微切割（LCM）
：通过激光切割特定单细胞，适用于组织切片
- 微孔板（Smart-seq2）
：单细胞逐个手动挑取，适用于低通量高精度测序
（2）细胞裂解与mRNA提取
-
由于单细胞RNA含量极低，通常需要优化裂解方法并使用寡聚dT磁珠富集mRNA，以去除rRNA和gDNA的干扰。
（3）cDNA合成与扩增
-
逆转录（RT-PCR）将mRNA转录为cDNA
-
采用PCR扩增或IVT体外转录扩增提高信号
-
常用扩增策略：
- Smart-seq2
：全长mRNA测序，适用于低通量研究
- Drop-seq/10x Genomics
：基于标签条形码的高通量测序，适用于大规模单细胞研究
- Smart-seq2
（4）文库构建
-
添加接头（Adapters）、条形码（Barcodes）等信息，生成测序文库。
（5）高通量测序
-
使用Illumina NovaSeq等平台进行高通量测序，读取单细胞转录组数据。
4. scRNA-seq 数据分析流程
数据分析主要包括预处理、质量控制、降维聚类、差异基因分析、伪时序分析、细胞通讯分析等。
（1）数据预处理
- 去除低质量细胞
（去除线粒体基因表达过高、基因检测数量过少/过多的细胞）
- 去除双细胞（Doublets）
- 归一化（Normalization）
：如log标准化、SCT（Seurat v3方法）
- 批次效应校正
：如Harmony、MNN（Mutual Nearest Neighbors）
（2）降维与聚类
- 主成分分析（PCA）
降维
- t-SNE、UMAP
可视化
- K-means, Louvain, Leiden
细胞聚类算法
（3）细胞类型注释
-
基于已知marker基因进行细胞类型鉴定（如单核细胞、T细胞、B细胞等）
-
使用单细胞参考数据库（如CellMarker, PanglaoDB）
（4）差异基因分析（DEG）
-
计算不同细胞群体的差异表达基因
-
采用Wilcoxon秩和检验、DESeq2、edgeR等方法
（5）细胞轨迹分析（Pseudotime）
-
使用 Monocle3、Slingshot、scVelo 推测细胞发育轨迹
（6）细胞通讯分析
-
采用 CellChat、CellPhoneDB 分析不同细胞群体之间的配体-受体相互作用
（7）基因调控网络
- SCENIC
等工具可用于识别单细胞水平的基因调控网络
5. 主流单细胞测序技术对比
| 方法 | 特色 | 适用场景 |
|---|---|---|
| Smart-seq2 | 全长转录本测序 | 低通量，高精度研究 |
| 10x Genomics | 高通量，基于微流控芯片 | 大规模细胞研究 |
| Drop-seq | 低成本，高通量 | 适合大规模细胞分析 |
| Seq-Well | 基于微孔板 | 适合组织样本分析 |
| MARS-seq | 适用于小量细胞 | 适用于微量样本 |
| SPLiT-seq | 细胞核分选，不依赖单细胞分离 | 适合复杂组织分析 |
6. scRNA-seq 发展趋势
- 多组学整合
：结合单细胞ATAC-seq、蛋白质组学等技术，实现更全面的细胞研究
- 时空转录组（spatial transcriptomics）
：结合空间信息解析组织微环境
- 单细胞代谢组、表观遗传学
：拓展至代谢、DNA甲基化等层面
- AI与大数据分析
：使用机器学习方法优化细胞聚类与注释
- 低成本高通量测序
：优化测序流程，降低成本，提高数据质量
7. 参考文献 & 资源
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scRNA-seq 经典文章
-
Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell, 2015.
-
Satija et al., Spatial Reconstruction of Single-Cell Gene Expression Data. Nature Biotechnology, 2015.
-
Trapnell et al., The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology, 2014.
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单细胞分析工具
-
Seurat（R）https://satijalab.org/seurat/
-
Scanpy（Python）https://scanpy.readthedocs.io
-
Monocle http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/
-
总结
单细胞转录组测序是当今生物学和医学研究的热点，广泛应用于细胞类型鉴定、发育轨迹推测、肿瘤微环境研究等领域。随着测序技术和数据分析方法的不断发展，scRNA-seq 将继续推动精准医学、细胞生物学和系统生物学的发展。
以下是 单细胞转录组测序（scRNA-seq）分析代码流程示例，使用 Seurat（R语言） 进行数据分析，并包含数据预处理、质量控制、降维聚类、细胞类型注释、差异基因分析、轨迹分析等关键步骤。
1. 安装和加载 R 相关包
# 安装所需 R 包（如果未安装）install.packages("BiocManager")BiocManager::install(c("Seurat", "SingleCellExperiment", "monocle3", "scater", "scran"))# 加载 R 包library(Seurat)library(dplyr)library(ggplot2)library(monocle3)library(scran)library(scater)
2. 读取单细胞数据
假设数据来自 10x Genomics（Cell Ranger 输出）
# 设置数据路径（假设 Cell Ranger 输出在 ./filtered_feature_bc_matrix/）data_dir <- "./filtered_feature_bc_matrix/"# 读取 10x 数据sce <- Read10X(data.dir = data_dir)# 创建 Seurat 对象seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = sce, project = "scRNA_seq", min.cells = 3, min.features = 200)# 查看 Seurat 对象seurat_obj
3. 质量控制（QC）
过滤低质量细胞（如基因数过低、线粒体基因比例过高）
# 计算线粒体基因比例seurat_obj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seurat_obj, pattern = "^MT-")# 绘制 QC 指标分布VlnPlot(seurat_obj, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)# 设定过滤标准（基因数 200-6000，线粒体基因比例 < 10%）seurat_obj <- subset(seurat_obj, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 6000 & percent.mt < 10)# 处理完的 Seurat 对象seurat_obj
4. 数据归一化
seurat_obj <- NormalizeData(seurat_obj, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
5. 识别高变基因
seurat_obj <- FindVariableFeatures(seurat_obj, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)# 可视化高变基因top10_genes <- head(VariableFeatures(seurat_obj), 10)VariableFeaturePlot(seurat_obj) + LabelPoints(points = top10_genes, repel = TRUE)
6. 数据缩放和主成分分析（PCA）
# 归一化数据seurat_obj <- ScaleData(seurat_obj, features = rownames(seurat_obj))# 进行 PCA 降维seurat_obj <- RunPCA(seurat_obj, features = VariableFeatures(seurat_obj))# 可视化 PCA 结果ElbowPlot(seurat_obj) # 用于选择合适的主成分数量DimPlot(seurat_obj, reduction = "pca")
7. 聚类分析
# 选择 20 个 PCA 进行最近邻计算seurat_obj <- FindNeighbors(seurat_obj, dims = 1:20)# 进行聚类（resolution 决定聚类的精细程度，0.5~1 通常是合理范围）seurat_obj <- FindClusters(seurat_obj, resolution = 0.5)# 可视化聚类结果DimPlot(seurat_obj, reduction = "umap", label = TRUE)
8. 细胞类型注释
# 查找差异表达基因seurat_obj.markers <- FindAllMarkers(seurat_obj, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)# 提取前 5 个 marker 基因top_markers <- seurat_obj.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 5, wt = avg_log2FC)# 细胞类型注释（基于已知 marker）FeaturePlot(seurat_obj, features = c("CD3D", "MS4A1", "LYZ", "PPBP")) # T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞, 血小板
9. 差异基因分析（DEG）
# 计算指定细胞群体的差异表达基因cluster1_vs_cluster2 <- FindMarkers(seurat_obj, ident.1 = 1, ident.2 = 2, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)# 可视化差异基因VlnPlot(seurat_obj, features = c("CD3D", "MS4A1")) # 可视化 T 细胞和 B 细胞 marker 基因
10. 轨迹分析（伪时序分析）
# 将 Seurat 对象转换为 Monocle3 对象cds <- as.cell_data_set(seurat_obj)# 进行降维（UMAP 方式）cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 20)cds <- reduce_dimension(cds)# 计算轨迹（learn_graph）cds <- learn_graph(cds)# 指定根节点（Root Cell）cds <- order_cells(cds)# 轨迹可视化plot_cells(cds, color_cells_by = "pseudotime")
11. 细胞通讯分析（CellChat）
# 安装并加载 CellChatBiocManager::install("CellChat")library(CellChat)# 初始化 CellChat 对象cellchat <- createCellChat(object = seurat_obj, group.by = "seurat_clusters")# 计算细胞通讯cellchat <- identifyOverExpressedGenes(cellchat)cellchat <- computeCommunProb(cellchat)# 细胞通讯可视化netVisual_circle(cellchat, weight.scale = TRUE, label.edge = TRUE)
12. 保存和导出数据
# 保存 Seurat 对象saveRDS(seurat_obj, file = "scRNA-seq_seurat_obj.rds")# 导出差异基因write.csv(cluster1_vs_cluster2, "DEG_cluster1_vs_cluster2.csv")
总结
这个 单细胞转录组（scRNA-seq）分析流程 包括： ✅ 数据预处理
✅ 质量控制（QC）
✅ 归一化和高变基因识别
✅ PCA 降维
✅ 聚类和 UMAP/t-SNE 可视化
✅ 细胞类型注释
✅ 差异基因分析（DEG）
✅ 伪时序分析（Monocle3）
✅ 细胞通讯分析（CellChat）
你可以根据具体研究需求调整参数，如 resolution 控制聚类粒度、logfc.threshold 控制差异基因阈值等。
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