转录组&16S全长揭示热应激削弱鲟鱼的皮肤屏障功能的机制

 凌恩生物客户四川农业大学动物科学学院近期在《Frontiers in Microbiology》期刊上(IF=6.064)发表的“Heat Stress Weakens the Skin Barrier Function in Sturgeon by Decreasing Mucus Secretion and Disrupting the Mucosal Microbiota.”研究论文中，通过转录组与16S全长扩增子联合分析，证明了热应激对鲟鱼皮肤不良影响主要表现为粘液分泌减少和粘膜微生物群紊乱。

期刊：Frontiers in Microbiology         

影响因子：6.064              

发表时间：2022

样本类型：西伯利亚鲟鱼皮肤组织和拭子

客户单位：四川农业大学

一、研究背景

全球变暖引起的热应激损害了水生动物的健康，过高或过低的水温都会导致鱼类生理功能障碍甚至死亡。热应激会影响渔业生态系统，使水产养殖的经济效益和发展受到限制。皮肤组织作为保护生物体的防御屏障起着至关重要的作用，然而，关于热应激对鱼皮的影响知之甚少，特别是在冷水鱼类中。皮肤粘液是表皮黏液细胞分泌的一种强粘性物质，覆盖在鱼皮表面，形成有效的保护屏障。而且，皮肤粘液上定殖着复杂的微生物群落，这些微生物群在抵抗环境病原体方面发挥着重要作用，可作为监测鱼类健康状况的标志物，快速诊断并提高其生长性能。

二、实验设计

在这项研究中，作者首先开展西伯利亚鲟鱼皮肤组织RNA-Seq，以揭示在24和28°C下遭受热应激的鲟鱼皮肤组织中的基因表达特征。通过组织学观察以评估热应激下西伯利亚鲟皮肤的病理变化。此外，作者通过16S全长高通量测序分析了鲟鱼皮肤微生物的群落结构。

图  实验设计

三、实验结果

1、RNA-Seq结果

测定了9个样本的转录组，每个样本的clean reads数量在2400~3400万之间，通过5个数据库注释，获得了172,158个带有注释信息的unigenes。在三个比较组（MS与C、HS与C、HS与MS）中共检测到28,072个差异表达基因(DEGs)，为了分析响应不同温度的基因，绘制了维恩图（图1A）。两个比较组共有3,903个DEGs，其中包括1,652个功能注释基因，转录组分析确定“ECM-受体相互作用”的通路（图1B），与蛋白质合成相关的通路（例如，蛋白质消化和吸收，内质网中的蛋白质加工）显著富集，“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”和“粘蛋白型O-聚糖生物合成”通路也显著富集，表明受到热应激影响显著。

同时分析了轻度热应激和高热应激刺激后非共有注释基因的表达差异，分别鉴定出1,494和3,032个非共有注释基因（图2）。转录组分析确定“角质形成细胞分化”和“角质化”功能相关基因在MS与C组中高度富集。

图1  MS vs C组和HS vs C组中共有DEG的Venn图和KEGG富集分析

图2  MS vs C和HS vs C组中非共有DEG的Venn图和KEGG富集分析

 2、热应激损伤皮肤表皮并减少粘液细胞数量

皮肤样本的组织学观察，与对照组相比，MS组的上皮层剥落和坏死，细胞碎片增多（图3）。HS组皮肤表皮层部分断裂，有轻微解离和表皮萎缩（图3C）。病理评分也表明MS和HS组有显著的病理变化（图3D）。PAS染色显示，与对照组相比，MS组和HS组的粘液细胞数量显著减少（图3E-G）。不同组粘液细胞数量的显著差异也证实了这些结果（图3H）。

图3 暴露于热应激后西伯利亚鲟鱼皮肤的组织学变化

3、16S rRNA全长扩增子测序结果

三种温度下鲟鱼皮肤表面微生物16S全长扩增子测序结果表明，三组共有77个OTUs，MS组微生物多样性较对照组略有下降，而HS组与对照组相似（图4A)。β-多样性分析显示，所有样本均分为三个相对独立的类别，表明微生物的多样性在组间存在差异（图4B），这与维恩图结果一致。 

图4 不同群体之间的物种组成分析

微生物组成分析表明，热应激导致皮肤微生物组成发生显著变化。在热应激下，门水平上最丰富的细菌类型是变形菌门和拟杆菌门（图5A）。在属水平上，受到热应激后Methylovirgula显著减少，而Rhodanobacter显著升高，特别是在加热后的HS组中，相对丰度为11%（图5B）。在三种热应激条件下，皮肤微生物群具有相同的菌群，但它们的比例不同，这表明热应激改变了鲟鱼皮肤微生物群的丰度。

 图5 热应激下门(A)和属(B)水平菌群的相对丰度

4、热应激会降低益生菌的丰度并增加潜在病原体的丰度

热应激组和对照组之间的皮肤微生物群存在显著差异（图6A、B）。根据功能将相对丰度>5%的微生物群筛选为潜在病原体和益生菌两大类，以进一步验证物种水平的这种差异（图6C）。尽管在少数微生物群中存在例外，但潜在病原体（例如Vibrionimonas, Mesorhizobium, Phyllobacterium）的相对丰度趋于增加，而优势益生菌（慢生根瘤菌和Methylovirgula）的相对丰度显著下降。

图6 鲟皮肤微生物群差异LEfSe分析

四、研究结论

在24和28°C的热应激下，观察到鲟鱼表皮层受损，皮肤黏液细胞数量减少，摄食率和蛋白质合成减少，证明了热应激会影响皮肤和粘蛋白构建的屏障。两种可能的机制是：热应激通过影响肠道摄入的能量来减少粘蛋白的合成；通过破坏表皮减少粘蛋白的产生，从而减少表皮中粘液细胞的数量。粘液的减少与皮肤微生物群落的变化密切相关，表现为益生菌丰度降低，潜在病原体丰度提高。总之，本研究表明，热应激对鲟鱼皮肤有不良影响，表现为粘液分泌减少和粘膜微生物群紊乱，这可能有助于制定全球变暖引起的热应激预防策略。

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参考文献

Heat Stress Weakens the Skin Barrier Function in Sturgeon by Decreasing Mucus Secretion and Disrupting the Mucosal Microbiota. Frontiers in Microbiology, 2022.