将传统的meta分析与孟德尔随机化结合，跟随顶级期刊找灵感！

孟德尔随机化减少Meta分析混杂效应

最近在看文献的时候发现了一种很棒的方法，可以有效弥补传统观察性研究meta分析中的反向因果和混杂效应问题，那就是孟德尔随机化。

今天分享的这篇文章正是将孟德尔随机化与meta分析结合的成果，类似的文章不多，时代在进步，新的玩法也在不断涌现，快来一起探索新思路吧！

题目：Homocysteine, folate, and nonalcoholic fatty liver disease: a systematic review with meta-analysis and Mendelian randomization investigation

杂志：AMERICAN JOURNAL OF CLINICAL NUTRITION

影响因子：IF=6.5

中科院分区：医学一区

发表时间：2022年12月

一、研究背景

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是主要的肝病原因之一，也是终末期肝病的主要原因。NAFLD是一种常见疾病，全球约有四分之一的人口受到影响。虽然NAFLD的确切原因尚不明确，但证据表明同型半胱氨酸可能发挥作用。同型半胱氨酸是在肝脏中主要通过甲硫氨酸代谢形成的中间氨基酸。小鼠研究表明，饮食诱导的高同型半胱氨酸血症会促进肝损伤和肝脂肪变性，而叶酸补充（对同型半胱氨酸的解毒至关重要）具有肝脏保护作用。然而，针对人类的观察性研究对于血清同型半胱氨酸和叶酸浓度与NAFLD风险的关联产生了相互矛盾的结果。

观察性研究的局限性，如残余混杂和因果关系反转，加上缺乏随机对照试验，使得评估同型半胱氨酸和叶酸在NAFLD中的作用时因果推断受到阻碍。孟德尔随机化（MR）是一种流行病学方法，通过利用遗传变异作为工具变量来增强暴露与结果之间的因果推断。与传统观察性研究相比，MR分析可能减少混杂效应和因果关系反转，因为1）遗传变异在受精时随机分配，因此与自我适应和环境因素无关；2）生殖系基因型不会因疾病的发生和发展而改变。

因此，作者进行了元分析，总结传统观察性研究的当前证据，并进行MR分析，以考察血清同型半胱氨酸和叶酸浓度与NAFLD风险的关联，从而促进因果推断。鉴于NAFLD患者通常存在肝功能受损和肝酶浓度异常，作者在MR分析中进一步研究了血清同型半胱氨酸和叶酸浓度与四种肝酶的关联，作为次要结果。

二、方法学

文献检索

① 数据库：Medline, Web of Science, and Embase

② 检索时间：从建库至2022年4月

③ 检索关键词：包括但不限于“Folic acid” and “Homocysteine” and “Non-alcoholic Fatty Liver Disease”。

纳入标准

1. 观察性研究：队列、病例对照、横断面研究；

2. 评估血清同型半胱氨酸或血清叶酸与NAFLD风险之间的关系;

3. 报告95%可信区间(Cl)的比值比(OR)、危险比(HR)或相对风险(RR)，或有足够的数据计算OR、RR或HR;

4. 对NAFLD的诊断给出详细的定义。

排除标准

1. 会议摘要、综述文章；

质量评价

使用纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle-Ottawa Scale）对纳入的研究质量进行了评估。两位作者依据评估系统，覆盖了研究人群的选择、可比性和暴露的识别，为每项研究给予“星级评分”。评分范围为1到9分：1-3分、4-6分和7-9分分别被认为是低质量、中等质量和高质量。

统计分析

① 合并数据：采用随机效应模型进行合并数据。

② 异质性检验：Q检验和I2统计来评估研究之间的异质性。

③ 发表偏倚检验：通过Egger's和Begg's检验、漏斗图评估发表偏倚。

孟德尔随机化

① 数据来源：NAFLD的汇总水平数据来自(UK生物银行、FinnGen队列、爱沙尼亚生物银行和eMERGE网络)的4个队列全基因组关联研究。

② 工具变量：选取了14个和2个不存在连锁不平衡的独立SNP（r² < 0.01）作为同型半胱氨酸和叶酸的工具变量。所选择的SNP能够反映相应基因多态性对血清同型半胱氨酸和叶酸浓度变化的实际影响，并共同代表MR分析中基因预测的血清暴露浓度。

③ 因果效应估计：采用逆方差加权法进行初步的孟德尔随机化（MR）分析。该方法通过对各SNP的Wald比估计值进行元分析，来获得因果估计值。

④ MR的敏感性分析：使用加权中位数方法、MR-Egger回归法和MR-PRESSO法进行了孟德尔随机化的敏感性分析，以评估结果的稳健性。

三、分析结果

纳入研究的特征

在3个数据库中共识别到1266项相关研究。在评估这些研究及检索到的综述研究的参考文献后，作者纳入了22项关于血清同型半胱氨酸浓度（n=20）和血清叶酸浓度（n=12）与NAFLD风险关系的研究，涵盖11545名NAFLD患者和18823名对照。NAFLD在8项研究中通过超声定义，13项研究通过肝活检定义，只有1项研究通过脂肪肝指数≥60或通过侵入性生物标志物计算的超声脂肪肝指数≥30来定义NAFLD。

纽卡斯尔-渥太华量表的平均评分为6.8（范围：5-9），表明纳入研究的质量为中等至高质量。只有1项研究报告了协变量缺失值的存在，但没有提供插补方法的信息。

Meta分析结果

结果显示，血清同型半胱氨酸与NAFLD呈正相关，而血清叶酸与NAFLD呈负相关。与低同型半胱氨酸组相比，高同型半胱氨酸组患NAFLD的比值比（OR）为1.96（95% CI: 1.57, 2.45）。与低血清叶酸水平者相比，高血清叶酸水平者患NAFLD的OR为0.75（95% CI: 0.58~0.99）。

MR分析结果

较高的基因预测血清同型半胱氨酸浓度与NAFLD风险增加相关。基因预测的血清同型半胱氨酸浓度每增加一个标准差，OR值为1.17（95% CI: 1.01, 1.36; P=0.039）。而遗传预测的血清叶酸浓度每增加一个标准差，NAFLD的OR值为0.75（95% CI: 0.55, 1.02; P=0.065）。基因预测的血清同型半胱氨酸浓度每增加1个标准差，ALT浓度变化为0.62 U/L（95% CI: 0.20~1.04；P=0.004）

在敏感性分析中，ALT的相关性仍然稳健。在AST、ALT和GGT的分析中检测到中度至高度异质性。同时，基因预测的血清叶酸浓度较高与ALT浓度降低有关，ALT浓度变化为-0.84 U/L（95% CI: -0.14, -1.54；P=0.018）。

四、讨论

本研究发现高血清同型半胱氨酸浓度与NAFLD风险增加之间存在一致的关联，且在元分析和孟德尔随机化分析中均得到了支持。高血清叶酸与NAFLD风险降低之间的逆相关关系在元分析中观察到，但在MR分析中未达到P < 0.05的显著性水平。此外，基因预测的较高同型半胱氨酸浓度和较低叶酸浓度与ALT浓度升高相关。综合来看，结果支持同型半胱氨酸浓度升高在NAFLD发展中的潜在作用，并暗示提高叶酸浓度可能降低NAFLD风险，这一观点值得进一步研究。

创新性

本研究的主要优势在于元分析与孟德尔随机化分析的结合设计，从人群和遗传角度增强了血清同型半胱氨酸和叶酸浓度与NAFLD风险之间关联的因果推断。此外，元分析和MR分析的关联在不同的敏感性分析中保持一致，进一步表明了研究结果的稳健性。

局限性

1. 水平多效性：研究未发现水平多效性迹象，MR–Egger截距测试和MR–PRESSO分析结果支持这一点。同型半胱氨酸的MR关联在所有敏感性分析中一致；

2. 叶酸分析局限：由于使用的SNP少于3个，无法对叶酸进行敏感性分析，但其关联基于MTHFR基因的SNP，生物学上不太可能受多效性影响人群局限性：MR分析仅限于欧洲人群，可能限制结果的普遍适用性，但元分析在多个地区（欧洲、亚洲、北美和南美）发现一致关联；

3. 人群局限性：MR分析仅限于欧洲人群，可能限制结果的普遍适用性，但元分析在多个地区（欧洲、亚洲、北美和南美）发现一致关联；

4. 功效不足：叶酸分析的功效可能不足，仅用2个SNP解释了血清叶酸浓度变异的小部分；

5. 非线性评估：无法基于汇总数据评估同型半胱氨酸和叶酸浓度与NAFLD风险之间的非线性关系；

6. 异质性和偏倚：元分析方法可能导致异质性和偏倚，但已发布和重新分析OR的亚组中未发现异质性；

7. 低统计功效：亚组分析的统计功效受到纳入研究数量的限制，未来研究需探讨潜在交互因素。

五、总结

研究人员在元分析和孟德尔随机化分析中发现高血清同型半胱氨酸浓度与NAFLD风险增加之间的一致关联。在元分析中，高血清叶酸与NAFLD风险降低呈负相关。结果支持同型半胱氨酸浓度升高在NAFLD发展中的潜在作用，并暗示叶酸水平升高可能降低NAFLD的发病风险。尽管研究方法看似简单，结合元分析与MR分析的常规套路，却能够实现1+1>2的效果，产生更有力的结果。这种方法确实为因果推断提供了更强的支持。