流式细胞术的染料分享FITC/藻红蛋白激发波长为 488nm 的荧光素
荧光素按激发光波长来分,主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类,其中,常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素,如FITC、PE、APC、PI等
激发波长为 488nm 的荧光素
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)FITC是应用最为广泛的一种荧光素,经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光,最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大,常随着PH的降低而减弱,因此,在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。
Alexa Fluor 488:Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料,Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致,经激光激发后发出绿色荧光,最大发射波长为519 nm,但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说,Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
藻红蛋白(phycoerythrin,PE)PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料,经激光激发后发出橙黄色荧光,最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点,可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中,PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。
PE-Cy5 PE-Cy5是一种复合染料,属于藻红蛋白偶联物,在此类复合染料中,激发能量可从PE传递到Cy5上,最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少,荧光干扰少,因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不适合与APC搭配使用,两者荧光重叠大。
PE-Cy5.5:PE-Cy5.5也是一种复合染料,能量从PE传递到Cy5.5上,最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样,PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小,可搭配使用,且其荧光强度要优于PE-Cy5。
PE-Cy7复合染料,最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠,与APC重叠也较少,因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意,PE-Cy7的光淬灭性很强,需要绝对避光环境。
PerCP-Cy5.5复合染料,最大发射波长为695 nm。与PerCP相反,PerCP的光量子产率较低,适用于表达水平较高物质的检测,PerCP-Cy5.5光量子产率高,可用于表达水平较低物质的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时,需要做补偿调节,但比PerCP补偿少。
PI/7-AAD:碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的最大发射波长分别为617 nm和647 nm,是常见的荧光染料,常用于细胞凋亡检测,可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上,PI在FL2或FL3通道检测,7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性,但其发射波谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。