单细胞转录组测序建库方法小结

背景知识

• 单细胞中RNA的种类和含量问题
  RNA中80%是rRNA，因此，首先要解决如何高效富集总RNA中的mRNA的问题；其次，在单个细胞当中mRNA大约只有0.2pg（1pg=10-12g），为了达到高通量建库所需的μg（1μg=10-6g）水平，需要对mRNA进行扩增，同时要控制扩增过程中的PCR偏好性。

• 单细胞转录组区别于单细胞空间转录组和单细胞免疫组

• 单细胞转录组建库方式也可以从其他角度进行分类

  • 全转录本建库
    例如Smart-seq2的建库方式，单细胞全mRNA转录组测序通过Oligo(d)T与mRNA的poly(A)尾结合，完成对mRNA高效富集。接下来，逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链，在到达mRNA的5’端特有的“帽子结构”，即甲基化的G碱基时，会在第一链cDNA的5’端继续连接几个C碱基，以便在第二链扩增过程中，使扩增序列中的rGrGrG结构能够与cDNA第一链结合。这样就保证在后续扩增过程中，所有片段两端的扩增引物结合序列一致，降低了由不同扩增引物结合序列导致的PCR偏好性。后续即可进行建库工作并完成测序。

  • 3‘端转录组建库
    与单细胞全mRNA转录组测序技术不同，3’端转录组测序技术在磁珠上预先锚定含有Truseq Read1（双末端测序Read1测序引物结合序列）、Barcode、UMI和PolyT等结构序列，在高效富集mRNA的同时，对每个细胞和mRNA引入标签，这样就可以在后续的扩增过程中进行“混样”，达到对单细胞进行高通量测序研究。相对于全长mRNA测序技术，3’端测序在文库构建的打断过程中，只保留同时含有Barcode、UMI和部分mRNA 3’端信息的片段。可以详细的参考10X genomics官网提供的技术支持信息。

  • 3’端VDJ建库等
    类似于3‘端转录组建库，不过磁珠上铆钉了TSO，barcode，UMI分子，oligo-dT游离于裂解液中，作为反转录引物合成cDNA第一链，cDNA的5’端与锚定在磁珠上的序列配对合成cDNA的第二链，然后进行特异链的扩增。（保留5‘端信息）

从其他角度对单细胞转录组建库方式进行描述如下：

微孔技术

以Smart-seq2为例：

• 单细胞分选
  单细胞悬液经过FACS分选到96孔板中，每个孔包含了lysis buffer和ERCC

• 扩增方式
  在孔板中，细胞被裂解后，oligo-dT作为反转录引物，其实合成从cDNA第一链，反转录酶具有在5’端加连续3个G的能力，所以完整的cDNA第一链5‘应具有GGG序列，然后TSO与其互补其实第二链合成，然后再扩增。最后使用Tn5转座酶插入测序引物，此时建库成功。

可以参考：https://www.jianshu.com/p/eeb61add2ac6?from=groupmessage

• 代表技术
  Smart-seq2 （比较主流，不过通量较小，建库成本贵）

微滴技术

• 单细胞分选
  单细胞悬液一个管道，beads，裂解液以及反转录酶等一个管道，还有一个管道是油，通过微流控芯片最后形成油包水的结构，油滴里面包裹着beads，细胞，细胞裂解液，反转录酶等。
• 扩增方式
  油包水的微滴形成后，细胞被裂解，beads上锚定了oligo-dT与ploy-A互补起始cDNA的第一链合成，然后反转录酶具有在5’端加连续3个G的能力，所以完整的cDNA第一链5‘应具有GGG序列，然后TSO与其互补其实第二链合成，然后再扩增。最后使用Tn5转座酶插入测序引物，此时建库成功。
• 代表技术
  10X genomics试剂盒

可以参考：https://www.jianshu.com/p/b506487d430d

总结

• 两中技术代表的发展方向不同：
  一个代表着获取更多的测序信号（获得更多的RNA分子种类）
  一个代表着获取更多的细胞捕获

• Smart-seq2优缺点

  • Smart-seq2利用现成的试剂比广泛商用的SMARTer kit生产更高质量的文库，成本便宜~12%，为分析大量细胞提供了可能性
  • 相对于截短的cDNAs，M-MLV逆转录酶更倾向于选择全长cDNAs作为其末端转移酶活性的底物。因此每个转录本的所有外显子都能被检测到，这使它可以用于检测可变剪接，还可以在转录本层面进行全面的SNP和突变分析，扩大了其应用范围
  • 不同I5、I7 Index组合使其能够进行多样品混合测序（但是通量相对于drop-seq还是略显较小）
  • 由于对聚腺苷酸化的RNA具有选择性，所以不能分析非poly(A)的RNA
  • 测序reads不带有mRNA链特异性
  • 有文献已经表示，Smart-seq2可以测定更多的RNA分子，且转录本覆盖度很高

• Drop-seq优缺点

  • 细胞通量较大
  • 低丰度的RNA分子可能会被dropout
  • 建库成本较低
  • 转录本覆盖度不均匀，3’ 的reads覆盖度较高
  • 会丢失部分转录本5‘端信息