背景知识
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单细胞中RNA的种类和含量问题
RNA中80%是rRNA,因此,首先要解决如何高效富集总RNA中的mRNA的问题;其次,在单个细胞当中mRNA大约只有0.2pg(1pg=10-12g),为了达到高通量建库所需的μg(1μg=10-6g)水平,需要对mRNA进行扩增,同时要控制扩增过程中的PCR偏好性。 -
单细胞转录组区别于单细胞空间转录组和单细胞免疫组
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单细胞转录组建库方式也可以从其他角度进行分类
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全转录本建库
例如Smart-seq2的建库方式,单细胞全mRNA转录组测序通过Oligo(d)T与mRNA的poly(A)尾结合,完成对mRNA高效富集。接下来,逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链,在到达mRNA的5’端特有的“帽子结构”,即甲基化的G碱基时,会在第一链cDNA的5’端继续连接几个C碱基,以便在第二链扩增过程中,使扩增序列中的rGrGrG结构能够与cDNA第一链结合。这样就保证在后续扩增过程中,所有片段两端的扩增引物结合序列一致,降低了由不同扩增引物结合序列导致的PCR偏好性。后续即可进行建库工作并完成测序。 -
3‘端转录组建库
与单细胞全mRNA转录组测序技术不同,3’端转录组测序技术在磁珠上预先锚定含有Truseq Read1(双末端测序Read1测序引物结合序列)、Barcode、UMI和PolyT等结构序列,在高效富集mRNA的同时,对每个细胞和mRNA引入标签,这样就可以在后续的扩增过程中进行“混样”,达到对单细胞进行高通量测序研究。相对于全长mRNA测序技术,3’端测序在文库构建的打断过程中,只保留同时含有Barcode、UMI和部分mRNA 3’端信息的片段。可以详细的参考10X genomics官网提供的技术支持信息。 -
3’端VDJ建库等
类似于3‘端转录组建库,不过磁珠上铆钉了TSO,barcode,UMI分子,oligo-dT游离于裂解液中,作为反转录引物合成cDNA第一链,cDNA的5’端与锚定在磁珠上的序列配对合成cDNA的第二链,然后进行特异链的扩增。(保留5‘端信息)
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从其他角度对单细胞转录组建库方式进行描述如下:
微孔技术
以Smart-seq2为例:
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单细胞分选
单细胞悬液经过FACS分选到96孔板中,每个孔包含了lysis buffer和ERCC -
扩增方式
在孔板中,细胞被裂解后,oligo-dT作为反转录引物,其实合成从cDNA第一链,反转录酶具有在5’端加连续3个G的能力,所以完整的cDNA第一链5‘应具有GGG序列,然后TSO与其互补其实第二链合成,然后再扩增。最后使用Tn5转座酶插入测序引物,此时建库成功。
可以参考:https://www.jianshu.com/p/eeb61add2ac6?from=groupmessage
- 代表技术
Smart-seq2 (比较主流,不过通量较小,建库成本贵)
微滴技术
- 单细胞分选
单细胞悬液一个管道,beads,裂解液以及反转录酶等一个管道,还有一个管道是油,通过微流控芯片最后形成油包水的结构,油滴里面包裹着beads,细胞,细胞裂解液,反转录酶等。 - 扩增方式
油包水的微滴形成后,细胞被裂解,beads上锚定了oligo-dT与ploy-A互补起始cDNA的第一链合成,然后反转录酶具有在5’端加连续3个G的能力,所以完整的cDNA第一链5‘应具有GGG序列,然后TSO与其互补其实第二链合成,然后再扩增。最后使用Tn5转座酶插入测序引物,此时建库成功。 - 代表技术
10X genomics试剂盒
可以参考:https://www.jianshu.com/p/b506487d430d
总结
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两中技术代表的发展方向不同:
一个代表着获取更多的测序信号(获得更多的RNA分子种类)
一个代表着获取更多的细胞捕获 -
Smart-seq2优缺点
- Smart-seq2利用现成的试剂比广泛商用的SMARTer kit生产更高质量的文库,成本便宜~12%,为分析大量细胞提供了可能性
- 相对于截短的cDNAs,M-MLV逆转录酶更倾向于选择全长cDNAs作为其末端转移酶活性的底物。因此每个转录本的所有外显子都能被检测到,这使它可以用于检测可变剪接,还可以在转录本层面进行全面的SNP和突变分析,扩大了其应用范围
- 不同I5、I7 Index组合使其能够进行多样品混合测序(但是通量相对于drop-seq还是略显较小)
- 由于对聚腺苷酸化的RNA具有选择性,所以不能分析非poly(A)的RNA
- 测序reads不带有mRNA链特异性
- 有文献已经表示,Smart-seq2可以测定更多的RNA分子,且转录本覆盖度很高
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Drop-seq优缺点
- 细胞通量较大
- 低丰度的RNA分子可能会被dropout
- 建库成本较低
- 转录本覆盖度不均匀,3’ 的reads覆盖度较高
- 会丢失部分转录本5‘端信息