检测DNA插入片段位置的Guide-seq实验方案

问题是，如果一段DNA插入基因组某个或者某些位置了，但是我们不知道其具体位置，希望通过测序的方法来检测这些位置信息。
最简单直接的办法当然是全基因组测序（最好还要是长度长的三代测序的），然后比对插入基因序列，找边缘序列（类似于嵌合体，一半是插入的基因序列，一半是基因组的序列）。但是这个办法相对来说成本比较高。那有没有相对简单的办法呢？答案当然是有的，就是Guide-seq。
其基本原理如下图所示：

图片出自Illumina官网
简述该流程步骤如下：

1. 准备好加入dsODN的细胞样本或DNA样本，按照常规文库构建办法建好PE文库，其中引入UMI分子标记；
2. 设计插入片段末端的特异性引物，联合P5通用引物对文库进行扩增，所得新的DNA库，进行二次扩增，完善P7端接头序列，即是含有插入片段和原本基因片段的文库。
3. 进行比对分析，确定插入位点。
   分析思路如下图：
   
   注意其中分析流程中需要去除冗余重复。

个人的一些理解：

1. UMI模式不一定测序厂商都会愿意测，因此UMI可以考虑设置在特异性引物外侧；
2. 特异性引物设计一定要经过确认；
3. 分析的时候注意过滤掉假阳性结果。

该方法的优点是，快速，容易操作，缺点是数据分析控制不好，实验过程中，也可能因为因为设计原因或者扩增原因导致一部分位点遗漏。分析流程也许需要慎重考虑。