前药靶向穿孔素抑制剂脑实质可减轻氧化应激和神经炎症，提高细胞存活率

前药靶向穿孔素抑制剂脑实质可减轻氧化应激和神经炎症，提高细胞存活率

芬兰东芬兰大学卫生科学系药学院（Janne Tampio1&Johanna Huttunen1&Ahmed Montaser1&Kristiina M. Huttunen）

摘要：

细胞溶解蛋白穿孔素在感染（？）和肿瘤监测中起着至关重要的作用。最近，它还与许多脑部疾病有关，如神经退行性疾病和中风。因此，穿孔素抑制剂作为新的候选药物备受关注。我们之前已经报道，将穿孔素抑制剂转化为L型氨基酸转运体1(LAT1)-利用前药可以改善化合物的脑药物转运，不仅可以跨越血脑屏障(BBB)，而且还可以进入脑实质细胞：神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。本研究评估了这种脑靶向穿孔素抑制剂前药对原代小鼠皮质星形胶质细胞摄取的增加和随后细胞生物利用度的提高是否能增强其药理作用，如在脂多糖(LPS)诱导的神经炎小鼠模型中抑制caspase-3/-7、脂质过氧化产物和前列腺素E2(PGE2)的产生。研究表明，增加脑和细胞给药可以提高穿孔素抑制剂在纳米到皮摩尔水平上诱导其在大脑中的药理作用的能力。此外，该前药还表现出多功能，因为它还抑制与阿尔茨海默病(AD)相关的几种关键酶的活性，如β位点淀粉样前体蛋白(APP)裂解酶1(BACE1)、乙酰胆碱酯酶(AChE)以及微摩尔浓度的环氧合酶(COX)。因此，该前药除了对抗脑组织内的神经炎症、氧化应激和神经细胞凋亡外，是一种潜在的预防Aβ积聚和ACh耗竭的候选药物。

**关键词：**星状细胞，脑靶向给药，L型氨基酸转运体1(LAT1)，Perforin抑制剂，前药

一、介绍

人们显然需要有效的药物来对抗中枢神经系统(CNS)疾病和紊乱，因为中枢神经系统紊乱是导致长期残疾的十大原因中的五种，占卫生保健总支出的30%以上[1]。据估计，在她/他的有生之年，每三个人中就有一个人患有可诊断的中枢神经系统疾病。此外，随着诊断技术的改进和日益老龄化人口的当前人口趋势，预计这些数字将会增加。不仅大多数神经退行性疾病，如帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏症(AD)和亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和多发性硬化症(MS)缺乏有效的药物治疗，而且同样适用于许多其他大脑疾病，如中风、创伤性脑损伤和病毒性脑感染[1-3]。尽管在揭示脑部疾病背后的病因方面付出了巨大的努力，但其多功能病理机制仍未被完全理解[4]。人们认识到，中枢神经系统药物治疗的大部分无效可以追溯到它们无法通过血脑屏障(BBB)[4，5]，更重要的是无法到达大脑中的特定靶细胞，如神经元或胶质细胞[6，7]。

穿孔素于1975年被发现，是一种钙依赖的后重整细胞溶解效应分子，可诱导靶细胞凋亡[8]。这种糖蛋白由两种细胞毒性效应细胞分泌：CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)[9，10]。靶细胞识别后，CTL和NK细胞释放细胞毒颗粒，包括穿孔素、颗粒酶和颗粒蛋白。穿孔素寡聚体可以在靶细胞的质膜上形成孔洞，从而允许颗粒酶进入，从而诱导靶细胞的凋亡。穿孔素也可以与颗粒酶一起运输到内体内的靶细胞中，然后穿孔素破坏细胞内的膜，释放诱导凋亡的颗粒酶[11]。因此，穿孔素在控制病毒感染和肿瘤监测方面起着至关重要的作用。

据报道，人类穿孔素等位基因有单核苷酸变异，对穿孔素的活性有多种影响[12]。穿孔素活性的变化反过来可以导致各种情况，从非常罕见但致命的儿童疾病家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症2型(FHL 2)[12]到淋巴瘤[13]以及非常常见但可控的1型糖尿病(T1 DM)[14]。最近，更多的兴趣集中在脑部疾病上。据报道，穿孔素在MS的Theiler鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)模型中的轴突损伤[15]，在实验性脑疟疾模型中的血脑屏障破坏和水肿[16]，在诱发癫痫和MS的小鼠模型中[17，18]，以及在实验性中风模型中的神经毒性[19]，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(MPP)中多巴胺能神经元的凋亡中发挥重要作用。奇怪的是，在MS、AD和HD患者的死后大脑中也发现反应性星形胶质细胞含有穿孔素，不是在颗粒中，而是在炎症区域周围的细胞质中[22]。这强调了穿孔素在发炎的大脑中的重要作用，因为在许多神经退行性疾病以及中风和病毒感染中，炎症与神经毒性间接相关[23]。

我们以前已经利用穿孔素蛋白的有效抑制剂的前体药物制备了L型氨基酸转运体(LAT1)[24]，并获得了增强的、定向的跨血脑屏障向大脑的药物输送[25]。我们最近还报道，通过利用LAT1，可以改善母体穿孔素抑制剂在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的脑内药物输送(即，酶生物转化后母体药物的细胞摄取和释放)[26]。因此，本研究旨在评估穿孔素抑制剂(PFI)(图1)的LAT1利用前药(PFI-PD)的细胞摄取增加是否也能改善脑内主要靶细胞之一，即小鼠原代星形胶质细胞的细胞生物利用度[27]。此外，随后的目的是首次证明，通过选定的炎症、氧化应激和凋亡生物标志物在体外和活体内脂多糖(LPS)诱导的炎症模型中进行评估，释放的穿孔素抑制剂的脑靶向性、靶细胞选择性摄取和生物利用度可以导致脑内疗效的增强。因此，本研究评估了穿孔素抑制剂及其脑源性前药作为多功能化合物对抗神经退行性疾病(如AD)的可行性[28-30]。

图1生物可逆L型氨基酸转运体1(LAT1)-利用穿孔素抑制剂(PFI)的前药(PFI-PD)

二、实验

原材料

在分析研究中使用的所有试剂和溶剂都是分析级或超梯度HPLC级的商品化和高纯度的试剂和溶剂。三氯化镁、乙二胺四乙酸-Na_2(2×H_2O)(EDTA)；尿素胆碱氯化物；4-(2羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)；硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙(2×H_2O)；双氯芬酸；牛血清白蛋白(BSA)；脂多糖(LPS)硫代巴比妥酸；丁基羟基甲苯。氯化钾、氯化钠和氢氧化钠购自J.T.Baker(荷兰德文特)；葡萄糖、甲酸、冰醋酸、乙腈和2-(N-吗啉基)乙磺酸购自VWR International(美国宾夕法尼亚州拉德诺)；二甲基亚砜、α-生育酚、碘化乙酰硫代胆碱和多奈哌齐购自Acropezil。采用Milli-Q梯度系统(美国马萨诸塞州米尔福德)净化水，自行合成了利用LAT1的前药(PFI-PD)及其母药(PFI)，其结构表征(1HN-M R，13C NMR，LC-MS)和95%以上的纯度(元素分析)已在我们先前发表的文献[24]中得到证实。

细胞培养

从出生2天的成年雄性小鼠(C57BL/6JOlaHsd；Jackson实验室，巴尔港，ME，美国)分离皮层和海马的原代星形胶质细胞。动物被安置和处理如下，通过将脑组织悬浮在含有10%热灭活胎牛血清(Gibco，ThermoFisher Science，沃尔瑟姆，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和青霉素(50U/mL)-链霉素(50μg/mL)的Dulbecco‘s或If id Eagle培养基(Gibco，ThermoFisher Science，Waltham，美国)中分离皮质和海马。将悬浮液研磨10次，然后在室温下1500rpm离心5min。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育30min，加入新鲜培养基，1500rpm离心5min。将星形胶质细胞培养在Dulbecco‘s改良Eagle培养基F-12培养基(DMEM/F2；Gibco，ThermoFisher Science，Waltham，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中，添加1-谷氨酰胺(2 mm；Euroclone S.p.A.，佩罗，米兰，意大利)、热灭活胎牛血清(10%)、青霉素(50U/mL)和链霉素(50μg/mL)。将细胞接种于涂有聚D-赖氨酸的培养瓶中，为了去除小胶质细胞，培养物在200rpm的转速下振荡2h，然后进行下面的实验。早些时候有报道称，这些培养物含有大约80%的星形胶质细胞(20%的小胶质细胞)[33]。人乳腺癌细胞MCF-7(HTB-22；RRID CVCL_0031)购自ECACC，Salisbury，UK，Cat。在标准条件下(37°C，5%CO2)培养，使用DMEM(Gibco，Thermo Fisher Science，Waltham，MA，美国)，添加l-谷氨酰胺(2 mM，Gibco，Thermo Fisher Science，Waltham，MA，美国)，热灭活胎牛血清(10%，Gibco，Thermo Fisher Science，Waltham，MA，美国)，青霉素(50U/mL，Gibco，Thermo Fisher Science，Waltham，Waltham。以下所有研究都是作为来自不同细胞传代的三个生物复制以及来自同一细胞传代的三个技术复制来进行的。用LAT1探针底物[14C]-L-亮氨酸在用过的细胞传代(7-16)之间跟踪LAT1的功能，并注意到没有改变。

Ability to bind LAT1(L型氨基酸转运体1)

为进行转运蛋白结合研究，实验前3d将星形胶质细胞接种于24孔培养板上，密度为10×104个/孔。去除培养液后，用预热的HBSS(含氯化胆碱125 mM、KCl 4.8 mM、MgSO4 1.2 mM、KH2PO4 1.2 mM、CaCl2 1.3 mM、葡萄糖5.6 mM、HEPES 25 mM)清洗，用1M NaOH调至pH7.4。实验前用5 0 0μLo FP r e-w a r m e dh B S Sa T3 7°CF或r 5min预孵育细胞。为了研究所研究化合物抑制已知LAT1底物摄取的能力，将细胞与摄取缓冲液(HBSS250μL)孵育5min，缓冲液中含有0.76mcI/mL(0.25mCI/mL或9.85MBq/mL)的[14C]-L-亮氨酸(美国马萨诸塞州PerkinElmer)和研究化合物的0.1mcM-1000mBq/mL(或以HBSS0.1-1000mBq/mL为空白)。孵育结束后，加入500μL冰冷HBSS停止摄取，用冰冷HBSS(2×500μL)清洗细胞2次。然后细胞用500MNaOH(0.1M)裂解60min，裂解液与3.5mL乳化剂安全鸡尾酒(Ultima Gold，PerkinElmer，Waltham，MA，USA)混合。用液体闪烁计数法(美国马萨诸塞州PerkinElmer Waltham的MicroBeta2Counter)测量细胞内的放射性。通过非线性回归分析计算最大抑制浓度(IC50)值的一半(将曲线拟合为对数浓度与剩余的归一化存活率)。

转运蛋白介导的细胞摄取

细胞摄取实验：实验前3d将星形胶质细胞接种于密度为10×104个/孔的24孔板上。用1~2 0 0μMi Np Re-w a r m e dh B S Sb u f r(2 5 0μL)的化合物与细胞在37℃孵育30min(摄取与所有化合物呈线性关系)，研究细胞对化合物的摄取。随后，用冰冷的HBSS洗涤细胞3次，并用250μLo FN a O H(0.1M)裂解60min。裂解产物用含选定内标(双氯芬酸)的乙腈(ACN)按1：3稀释，10,000×g离心10min。使用安捷伦1200系列快速分辨LC系统和配备电喷雾电离源的安捷伦6410三重四极质谱仪，使用Poroshell120EC-C-18色谱柱(50 mm×2.1 mm，2.7μm；安捷伦)，用前面描述的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法分析PFI(PFI-Pd被测量为释放的母药，因为它在0.1M氢氧化钠中完全转化为此类物种)。样品的定量下限(LLOQ)为0.5 nM，在1.0~100 nM范围内具有良好的线性选择性、准确度(RSD<15%)和精密度(RSD<15%)。每种化合物在细胞裂解产物中的浓度通过将已知数量的化合物添加到ACN(包括选定的内标)而制备的标准曲线计算，并与蛋白质浓度进行归一化。根据Bradford染料结合法，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白Mol Neurobiol，并通过多板读取器(enVision，Perkin Elmer，Inc.，Waltham，USA，USA)测量吸光度(595 Nm)，通过BioRad Protein Assay将每个平板上的蛋白质浓度测定为三个样本的平均值。在Bradford染料结合法的基础上，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白质Mol Neurobiol，并通过多板读取器测量吸光度(595 Nm)。

细胞内游离浓度

用快速平衡透析(RED)装置(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Science，Inc.)测定化合物(100μM)在星形胶质细胞匀浆中的非特异性结合。简单地说，星形胶质细胞悬液(10×106cells/mL)与HBSS一起用SoniPerp 150Plus粉碎机(MSE有限公司，英国伦敦)匀浆(2s×3)。将所研究的化合物与100μL的细胞匀浆混合，加入反应室。缓冲室中加入350-μL HBSS缓冲液。透析板在37°C下摇动孵育4h。从反应和缓冲室中取出50微升样品，并分别加入同等大小的缓冲液或空白匀浆，以产生相同的基质。加入100μLO的冰冷ACN沉淀蛋白(包括选定的内标，见上)，在12,000×g离心10min后收集上清液进行LC-MS分析(见上)。游离药物分数(fu，cell)是通过缓冲室浓度除以反应室浓度，并考虑匀浆稀释因子的影响(D=4.5f或r1.0×106cells/mL细胞悬液，根据细胞的重量)计算出来的[34，35]。

星形胶质细胞的复合浓度比(KP)是通过比较每细胞体积(10×104个细胞/孔)的细胞裂解物(0.1MNaOH)中的细胞摄取量(0.05810μ15L/cell)[36]和在细胞裂解前收集的周围缓冲液(Hbss)中检测到的浓度(NM)来确定的，如前所述[34]。然后用药物浓度比(Kp)乘以未结合药物分数(fu，cell)[34]，计算出未结合药物浓度比(Kp，Uu)。

影响细胞生长的能力

将原代星形胶质细胞或人乳腺腺癌细胞(MCF-7)以20×103个/孔的密度接种于胶原包被的96孔板上。接种后1d进行细胞增殖实验。将所研究的化合物(5~400μM)加入到生长培养基中，与原代星形胶质细胞孵育3d(每日测量后，用所研究的化合物将培养基更换为新鲜的培养基)。与MCF-7细胞共孵育时，培养液中含有100μM的顺铂，含或不含所研究的化合物(10-400μM)。每天用Resazurin细胞增殖试剂盒(Sigma，St.Louis，MO，USA)测定细胞活力，细胞活力与细胞的有氧呼吸和细胞代谢成正比。通过使用enVision平板阅读器(enVision，Perkin Elmer，Inc.，Waltham，MA，USA)监测λex560 nm和λem590 nm处的荧光增加，对样品进行荧光测量。在显微镜下观察细胞存活率。与未经处理的对照组相比，化合物抑制细胞活性的能力以百分比(%)表示。

动物实验

成年雄性C57BL/6JOlaHsd小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA)由Envigo(Venray，荷兰)提供。小鼠饲养在不锈钢笼子中，光照12h(07：00_{19：00)，黑暗12h(19：00}07：00)，环境温度22±1°C，相对湿度50~60%。所有的实验都是在光相进行的。自来水和食物颗粒(Lactamin R36；Lactamin AB，Södertälje，瑞典)可随意提供。LPS250μg/kg腹腔注射，每日1次，连续3d，第4天断头，诱发神经炎症。实验动物分为四组(每组6只)：(1)脂多糖处理组，(2)脂多糖及所研究化合物(30μ/kg；iv)处理组。在第4天断头前3d 120min(预防效果)，(3)脂多糖治疗3d和所研究化合物(30molmol/kg；iv)。(3)给小鼠注射脂多糖(30mol/kg；iv)，3d后处死小鼠。(3)腹腔注射脂多糖(μ)3d。(4)对照组小鼠腹腔注射0.9%NaCl溶液。每日一次，连用3天。断头后采集小鼠血液和脑标本。血浆在1500×g离心6min后分离。血浆层以12000×g的速度再次离心，去除血小板。血浆保存在−80°C，直到分析。将这些大脑快速冷冻在液氮中，并将其保存在−80°C下，直到进行分析。

抑制Caspase-3/-7蛋白含量

研究了这些化合物对冰冻小鼠脑组织中caspase-3和caspase-7酶活性的影响。组织块(n=3)在50 mM Tris-HCl(pH 7.4)1：10(w/v)中用珠磨机匀浆。匀浆在+4°C下10000×g离心5min，收集上清液进行检测。酶活性测定采用Apo-one均相Caspase-3/7试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI，USA)。该分析是在96孔板上进行的，每个样品有3个重复。每个样品孔包含100μL先前收集的上清液和100μL制备的载脂蛋白-1试剂。空白测定采用匀浆缓冲液和ApoONE试剂。一旦所有的样品和试剂都被输送到井中，将培养板仔细摇晃30s，然后在室温下黑暗中孵育Mol Neurobiol。用envision2104多标记阅读器(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的PerkinElmer)孵育后，用λex499 nm和λem521 nm测量荧光。在0.5~24小时内多个时间点重复测量。

抑制氧化应激和脂质过氧化(丙二醛形成)

原代星形胶质细胞以2×105个/孔的密度接种于胶原包被的6孔板上。接种2d后，用0.1μg/mLLPS在37°C预热HBSS缓冲液(250μL)中处理24h，对照组仅用预热HBSS缓冲液处理。将所研究的化合物(50μM)与脂多糖一起加入预热的HBSS缓冲液(250μL)中，37°C孵育24h，以维生素E-生育酚(α-tocopherol，VE)为阳性对照，评价化合物对氧化应激的抑制作用。随后，用DPBS(Dulbecco‘s磷酸盐缓冲液；Gibco，ThermoFisher Science，Waltham，MA，USA)洗涤细胞，用胰蛋白酶从平板上分离(Gibco，ThermoFisher Science，Waltham，MA，USA)，1000×g离心5min。取上清液，再用0.1M MES缓冲液(pH 6.0)悬浮，超声10min，4°C离心15min，收集上清液。脑组织标本均质后收集上清液(caspase-3/-7样品制备)，用50 mM Tris-HCl(pH 7.4)1：2稀释。

丙二醛测定：收集脑组织上清液100μLo ft(n=4)，100μL 10%(w/v)三氯乙酸，75μLo fH2O，5μLo f丁基羟基甲苯(0.01%)，最后20μLo h i o b a r b i t u r i ca c i d(10M)w e em i x e da n di n c u b。以10,000×G离心10min，收集上清液进行UHPLC-UV分析。该仪器由安捷伦1290 Infinity II LC系统(安捷伦技术公司，加利福尼亚州圣克拉拉)和安捷伦1290 Infinity II二极管阵列探测器(DAD)(G7117B)组成。采用Zorbax Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8μm)色谱柱。流动相为含0.1%(v/v)甲酸的水(洗脱液A)和含0.1%(v/v)甲酸的乙腈(洗脱液B)。分析梯度为0_{0.5min：10%B，0.5}2min：10%→25%B，2_{3min：25%→80%B，3}4.5min：80%B，4.5min_{5.5min：80%→10%B，5.5min}6min：10%B，流速1.0mL/min，进样量1μL，柱温25°C。使用OpenLab CDS软件版本2.3(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)收集并编译色谱数据。从标准曲线定量每个实验中的丙二醛含量；将不同量(1_{100μM)的丙二醛和硫代巴比妥酸在95°C的热塑机中孵育1h，同时作为每个研究批次的重复进行分析。结果在细胞实验中分析为每毫克蛋白质形成的丙二醛微摩尔(μ摩尔)(μ摩尔)(如上所述通过Bio-Rad蛋白分析)，或在体内测试中分析为每毫克组织中的丙二醛(μ摩尔)。丙二醛的定量下限为1μM，标准曲线的线性范围(1}2 0 0μM)、选择性、准确度和精密度适宜。质控样品的批内准确度和精密度均为标称浓度的±20%。

抑制前列腺素E2(PGE2)的产生

研究化合物在LPS诱导后抑制小鼠脑内PGE2产生的效果被评价为治疗和预防治疗。按上述方法制备脑组织匀浆上清液(caspase-3/-7样品制备)，用50 mM Tris-HCl(pH7.4)1：2稀释。用含有内标PGE2-d4(Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI，USA)的80%甲醇(v/v)溶液进一步稀释稀释的脑上清液1：5。稀释液在−80°C下提取过夜，然后在4°C下14,000×g离心10min，分两次进行LC-MS/MS分析。在质谱分析之前，使用Agilent1290Infinity LC系统(Agilent Technologies，Waldbron，德国)，Poroshell120EC-C18柱(50 mm×2.1 mm，2.7μm)用于液相色谱。对于MS分析，使用具有电喷雾电离源的Agilent 6495三重四极质谱计(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的Agilent Technologies)。洗脱液为含0.1%(v/v)甲酸的水(洗脱液A)和含0.1%(v/v)甲酸的乙腈(洗脱液B)。分析采用梯度法：0~5m in：15%B→35%，5_{9.5min：35%B→95%，9.5}12min：95%B，12_{12.1min：95%B→15%，12.1}14min：15%B，流速0.5mL/m in，进样量5μL，柱温40°C，采用负离子模式质谱分析，干燥气(氮)温度230°C。干燥气体流量为15L/min，雾化气体压力为30psi，鞘气温度为400℃，鞘气流量为12L/min。毛细管电压为4500V。分析物检测使用多重反应监测，前列腺素E2的转变为351.4→315.4和351.4→271.1(限定子)，前列腺素2-d4的转变为355.4→319.4和Mol Neurobiol 355.4→275.1。所有离子的碎裂电压为380V，碰撞能分别为9V、21V、9V和21V。使用Agilent MassHunter工作站软件(B.06.00版)采集数据，并用定量分析软件(B.07.00)进行处理。PGE2的定量下限(LLOQ)为1 nM。该方法的线性范围(1-100 nm)、选择性、准确度和精密度均可接受。质控样品的批内准确度和精密度均为标称浓度的±20%。

乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制作用

用乙酰胆碱(1 MM)测定乙酰胆碱酯酶(AChE)活性和丁酰胆碱酯酶(1 MM)测定BChE活性，用终点酶法测定了化合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)的抑制活性，并用小鼠br a i NS9f a c t i o nb yt h EE l l m an‘s法测定了它们的抑制率。结果表明，所研究化合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)均有抑制作用。用50 mM Tris-Buffered生理盐水(pH 7.4)(1：4w/v)匀浆，9000×g4℃离心20min，收集上清液，制备小鼠脑S9组分。上清液用磷酸盐缓冲液(100 mM，pH7.0)稀释1：10，与Ellman试剂(DTNB，1 mM)混合，在96孔板上研究化合物在二甲基亚砜(DMSO)中(浓度小于0.5%)作为3种平行分析方法。在用enVision平板阅读器(enVision，Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)在412 nm处读取吸光度之后，加入乙酰硫胆碱或丁酰硫胆碱并摇动，每隔5min至30min读取AChE或BChE的酶活性。所研究的化合物抑制AChE或BChE(μμ/m in/mg蛋白)比活性所需的浓度范围为1-800min，为每种生物介质中每种化合物在终点(30min)最大抑制浓度(IC_(50))的一半。以非选择性胆碱酯酶抑制剂他克林和乙酰胆碱酯酶选择性抑制剂多奈哌齐作为阳性对照。

使用20μM至1 mM的AChE底物乙酰硫胆碱，在PFI-PD和PFI的存在下(分别为8或12μM，根据其IC50值，表1)评估化合物的具体抑制类型。根据Hanes-Woolf曲线图，绘制了初始底物浓度与反应速度的比值([S]/v)与底物浓度(μM)的关系曲线。用线性回归计算Km值(X截距负值)和Vmax值(1/斜率)。

羧酸酯酶的生物转化

用人重组羧酸酯酶CES1b和CES2(德国达姆施塔特默克KGaA)在37℃下测定了重组酶对前药(PFI-PD)转化为母药(PFI-PD)的作用。将重组酶(终蛋白浓度为10 0μg/mL)与TBS缓冲液(pH7.4)和5 mM前药原液在二甲基亚砜(终浓度，二甲基亚砜浓度2%)中混合制成温育混合物。在前药浓度为10~100μM的条件下，测定酶动力学。反应混合物孵育10min，在终点提取样品(60μL)。样品中的蛋白质用60μL的冰乙腈沉淀，室温下以12,000rpm离心5min。用上述LC-MS/MS方法收集和分析上清液(完整的前药和释放的母药)[25]。将给定时间内母药的产生速度与蛋白量(Mol/μ/mg蛋白)进行归一化，并与所研究的浓度作图，得到各酶亚型酶反应的米氏动力学参数(V_(Max)和K_m)。

β位点淀粉样前体蛋白裂解酶1的抑制作用

采用荧光共振能量转移(FRET)肽技术(SensoLyte©520BACE1Assay Kit，AnaSpec，Inc.，Fremont，CA，C o l)，根据制造商的说法，采用荧光分光光度法筛选所研究化合物对纯化的人β位点淀粉样前体蛋白(APP)裂解酶1(BACE1)的抑制作用。方法：采用荧光共振能量转移(FRET)肽技术(SensoLyte©520BACE1Assay Kit，AnaSpec，Inc.，AnaSpec，Inc.，Fremont，CA，Col.)。简而言之，1μMn D1 0μM与FRET底物(QXL®5 2 0/HiLyte™Fluor488)和活性BACE1酶在室温下孵育30min。FRET多肽序列来源于瑞典突变的β-淀粉样前体蛋白(β-淀粉样前体蛋白，APP)的β分泌酶裂解位点，它增强了APP的分泌酶以处理APP，从而导致AD的早期发病。因此，活性的β-分泌酶将FRET底物切割成两个单独的片段，导致HiLyte™Fluor488荧光的释放，该荧光由enVision平板阅读器(enVision，Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)在λex490 nm和λem520 nm处测量。用试剂盒(KTEEISEVN-STA-VAEF-NH2)与对照样品和特异性抑制剂(0.25μMP r o v i d)比较了所研究的化合物(1-10 mmol M)对该荧光团数量的影响[38]。结果以百分比(%)表示，对照样本代表100%的β分泌酶活性。

数据分析

所有的统计分析，包括Michaelis-Menten、EadieHofstee和Hanes-Woolf分析，都使用GraphPad Prism v5.03软件(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行。组间比较采用单因素方差分析、Tukey‘s多重比较检验，均数±标准差表示，差异有统计学意义(*P<0)。0 5，**P<0.0 1，*P<0.0 0 1

伦理声明

涉及动物的实验程序是根据欧盟委员会第2010/63/EU和86/609号指令制定的，并得到了东芬兰大学机构动物保护和使用委员会的批准(动物使用计划编号ESAVI/3347/04.10.07/2015)。已尽一切努力将使用的动物数量降至最低，并将它们的痛苦降至最低。

结论

LAT1利用穿孔素抑制剂前药结合星形胶质细胞LAT1的能力

我们最近鉴定了小鼠原代星形胶质细胞的LAT1表达(3.1±0.9fmol/μg蛋白)和功能([14C]-L-亮氨酸上调Vmax2.9±0.4nmol/μ/mg蛋白；Km66±14 nmol/min M)[39]。因此，LAT1利用前药(PFI-PD)与LAT1结合的能力被评估为细胞摄取[14C]-L-亮氨酸的最大抑制(IC50值)的一半(0.76KMH M)，并与亲本穿孔素抑制剂(PFI)以及已报道的LAT1抑制剂(KMH-233)的值进行了比较[37]。前药被发现与星形胶质细胞中的LAT1结合，具有非常低的微摩尔IC50值(表1)，而PFI与LAT1没有表现出任何相互作用。此外，前药与LAT1结合的能力被认为很高，因为它的IC50值比已报道的LAT1抑制剂低4倍(表1)。

表1穿孔素抑制剂(PFI)及其前药(PFI-PD)和LAT1抑制剂(KMH-233)[37]与LAT1结合的能力以LAT1探针底物[14C]-L-亮氨酸摄取的半数最大抑制浓度(IC50值)表示。

LAT1利用穿孔素抑制剂前药对星形胶质细胞的摄取

原代小鼠星形胶质细胞对PFI-PD和PFI的摄取呈浓度依赖性(图2)。前药的最大转运能力(Vmax)为54±7nmol/min/mg蛋白，是母药的近40倍(Vmax为1.4±0.4nmol/min/mg蛋白)。奇怪的是，Eadie-Hofstee分析显示PFI-PD有一个自动激活的Eadie-Hofstee轮廓(图2ainset)。因此，该前药能够诱导LAT1功能或增加其在质膜上的表达[40]。由于这种自激活，摄取曲线几乎是线性的，动力学参数Vmax和Km(720LATM)相对较高，并不能反映典型的μ-1介导的细胞摄取。有趣的是，根据Eadie-Hofstee图，PFI可以利用两种不同的转运机制(Vmax0.036±0.007μ/mg蛋白和Km8.3nmol/μ-dVmax2.53±0.17nmol/μ/mg蛋白和Km680 nmol/min/mg蛋白)。

在这项研究中，我们还评估了PFI-PD和PFI的细胞内游离药物浓度，因为当药物靶点位于细胞内时，只有游离药物浓度可以被认为是药理相关的，就像大多数新药一样[41]。利用Mateus等人报道的一种方法，可以估计非结合药物的积累率，即Kp，Uu，cell value，因为该方法结合了稳态的细胞内总药物浓度和细胞内结合[34]。在这项研究中，我们评估了50 nm的Kp、Uu、cell浓度，这相当于大脑总Cmax的一半(0.12nmol/g组织)，而且是所用LC-MS/MS方法所能检测到的最低摄取浓度。前药的游离分数(Fuvalue)远低于母药(表2)。但是，由于PFI-PD对星形胶质细胞的摄取较高，PFI-PD具有更好的细胞生物利用度(Kp，Uu，细胞值2.01±0.91)。尽管游离游离率较高，但低于500 nM的细胞裂解液中未检测到PFI。

**图2 **LAT1利用前药(PfI-PD)(A)及其母药穿孔素抑制剂(Pfi)(B)进入原代星形胶质细胞的细胞摄取，浓度范围为1-200μM(平均值±SD，n=3-9)，Eadie-Hofstee曲线图如插图所示

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药影响细胞生长的能力

在本研究中，用不同浓度(5-400μM)的PFI或其利用LAT1的前药与原代小鼠星形胶质细胞孵育72小时，也观察到PFI对原代星形胶质细胞有抑制增殖的作用，在较高浓度(即100μM以上)时，对星形胶质细胞的生长有38-68%的抑制作用，而前药对星形胶质细胞的生长没有任何抑制作用(图3)。奇怪的是，1穿孔素抑制剂(PFI)、穿孔素前药(PFI-PD)和LAT1抑制剂(KMH-233)[37]与LAT1结合的能力表现为LAT1探针底物的半数最大抑制浓度(IC50值)，[14C]-L-亮氨酸摄取化合物对星形胶质细胞(μM)的IC50无抑制作用，PFI-PD3.5±1.1LAT1抑制剂14.4±1.2。

已知抗癌剂顺铂通过caspase(-3，-6，-7和-8)依赖和独立的机制诱导细胞程序性死亡[42-44]，由于caspase-3负责神经元和星形胶质细胞的凋亡[45]，我们想要探索利用LAT1的前药是否能影响体外顺铂诱导的细胞存活率下降。不幸的是，原代星形胶质细胞即使在非常低的浓度下也对顺铂非常敏感，因此，我们使用人MCF-7乳腺癌细胞来证明所研究的化合物对caspase介导的凋亡的效果。正如预期的那样，100μM顺铂作用72h后，对MCF-7细胞的生长抑制率为51%(图4)。有趣的是，PFI-PD能够以浓度依赖的方式逆转顺铂诱导的细胞效应。当药物浓度为50μM或更高时，对照细胞和经该化合物处理的细胞活力无统计学差异，而当药物浓度为50~400μM时，细胞活力明显高于顺铂处理组。相反，PFI不能逆转顺铂对细胞活力的影响，即与对照细胞相比，细胞活力显著降低。

图3 原代星形胶质细胞经5-400mM穿孔素抑制剂(A)及其LAT1利用前药(PFIPD)(B)孵育72h后的细胞活力(%)，与未处理的细胞(Ctrl)比较(平均值±SD，n=3~6)。星号表示与各自对照的差异有统计学意义(**P<0.01，*P<0.001，单因素方差分析，紧随其后的是Tukey‘st e s

图4 顺铂(100μM)孵育72h或10-400μM LAT1利用前药(浅灰色条)或穿孔素抑制剂(深灰色条)与100μM顺铂共同作用72h后的细胞存活率。数据以处理组与未处理细胞(Ctrl)的百分比(%)表示(平均值±SD，n=3-6)。星号表示与相应的对照组或顺铂诱导组(用单独的直线表示)相比有统计学意义的差异(*P<0.001，单因素方差分析，随后进行图基检验)。

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药对Caspase-3/-7蛋白含量的影响

靶细胞上穿孔素孔的形成导致颗粒酶渗入细胞，随后通过caspase依赖和独立的途径进行凋亡[9]。因此，我们研究了利用LAT1前药改善脑部给药与LPS诱导的小鼠脑内caspase-3/-7水平的相关性，并与其母药治疗进行了比较。选择LPS模型进行这项研究是因为它简单，而且据报道，该模型中的免疫调节和细胞凋亡是通过穿孔素和caspase-3依赖的途径介导的[46，47]。脂多糖(250molg/kg)连续给药3d，评价化合物的疗效，仅在第3、4d给予化合物(30molmol/kg)，或作为预防性治疗，在给药的同时给予化合物4d和3d的内毒素治疗。(2)给予脂多糖(30molmol/kg)，连续给药3d；(2)给予脂多糖(μ)30mol/kg，连续给药3d。尽管LPS对caspase-3/-7水平的影响很小(137%)，但仍有统计学意义。此外，PFI-PD治疗降低了两种情况下caspase-3/-7的含量，治愈性(63%)和预防性(68%)，值得注意的是，低于对照水平(图5)。母药则没有看到同样的效果(在根治性治疗和预防性治疗中分别为105%和156%)。

表2穿孔素抑制剂(PFI)及其LAT1利用前药(PFI-PD)在50 nM浓度下的游离分数、fu、细胞(%)和游离药物积累率、Kp、Uu、细胞值

图5 30μ/kg穿孔素抑制剂(深灰色条)及其利用LAT1前药(浅灰色条)对脂多糖诱导的神经炎症大鼠连续3天(250μg/kg/d)Caspase-3/-7水平的抑制作用。研究的化合物仅在实验的第3天和第4天作为根治性治疗，或作为预防性治疗，与LPS一起每隔4天给药一次。数据以平均值±标准差(n=3)表示。星号表示与相应的LPS组或对照组相比差异有统计学意义(*P<0。0 5，**P<0.0 1，单因素方差分析，随后进行Tukey‘s检验)

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药抑制氧化应激和脂质过氧化的能力

由于已知氧化应激可通过几种途径(如通过线粒体或内质网途径)诱导caspase-3/-7的产生[48]，因此我们在脂多糖诱导的原代星形胶质细胞(0.1μg/mL)和脂多糖诱导的小鼠中检测了脑靶向PFI-PD及其母药PFI的抗氧化功效。如图6a所示，两个被研究的化合物(50μM)在与脂多糖共同孵育24小时后，均能抑制氧化应激和随后的脂质过氧化反应，以丙二醛生成量为指标，可抑制原代星形胶质细胞30-59%的氧化应激和随后的脂质过氧化反应。此外，在这些共处理中，脂质过氧化水平与对照组相当(12.96±1.47mol/mg蛋白)。阳性对照50μMα-生育酚对脂多糖诱导的丙二醛的形成也有同样的抑制作用，抑制率为39%。因此，该前药对丙二醛形成的抑制作用是已知抗氧化剂α的1.5倍。生育酚的效果几乎是其相应母药的2.0倍。

脑组织中的丙二醛水平也是从与caspase-3/-7蛋白含量相同的脑组织样本中检测出来的。除了caspase-3/-7外，LPS还显著增加了脑内的脂质过氧化作用(图6b)。两种被研究的化合物都能减少31-46%的丙二醛生成，其中PFI-PD的疗效最好。然而，在这些化合物之间没有观察到统计学上的显著差异。

图6 a体外培养24小时后，50μM穿孔素抑制剂及其LAT1利用前药(PFI-PD)和维生素E(α-tocopherol，TOCO)对脂多糖诱导的原代星形胶质细胞脂质过氧化的抗氧化作用。b30μ/kg穿孔素抑制剂(深灰色线条)及其LAT1利用前药(浅灰色线条)的抗氧化作用。所研究的化合物仅在实验的第3和第4天给小鼠作为治疗性治疗，或作为预防性治疗与LPS一起给药4d。用丙二醛(MDA)在星形胶质细胞(归一化为蛋白质含量INA)或脑中形成的丙二醛(MDA)来测量氧化应激。数据以平均值±标准差(n=3-4)表示。星号表示与相应的LPS组或对照组相比差异有统计学意义(*P<0。0 5，**P<0.0 1，*P<0。0 0 1，单因素方差分析，后跟Tukey‘st e s t

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药抑制脑PGE2产生的能力

由于利用LAT1的脑靶向前药能够抑制与神经炎相关的细胞凋亡和氧化应激，我们很想知道它是否也能影响炎症标志物，因此，我们从大脑样本中测量了PGE2的水平。如图7所示，由于环氧合酶2(COX2)酶[49，50]的诱导，L PS显著增加了脑内PGE2的产生(从5.72±1.83增加到16.56±2.45nmol/mg组织)。。这种情况在治疗和预防治疗中都有发生(5.32±0.85-7.49±0.48nmol PGE2/mg组织)，尽管治疗组之间没有显著差异(PGE2/mg组织中PGE2含量为5.32±0.85-7.49±0.48nmol/mg组织)。

图7 穿孔素抑制剂30μ/kg(深灰色线条)及其利用前药(PfI-PD)(浅灰色线条)对脂多糖诱导的神经炎症小鼠脑内前列腺素E2(PGE_2)产生的抑制作用(每日250mol/kg，连续3天)。(2)穿孔素抑制剂(深灰色条)及其利用前药(PfI-PD)(浅灰色条)对脂多糖诱导的神经炎小鼠脑内前列腺素E_2(PGE_2)生成的抑制作用(每天250μg/kg，连续3天)。所研究的化合物仅在实验的第3和第4天给小鼠作为治疗性治疗，或作为预防性治疗与LPS一起给药4d。数据以平均值±标准差(n=4)表示。星号表示与相应脂多糖或对照组的差异有统计学意义(*P<0.001，单因素方差分析，紧随其后的是Tukey‘st e s t

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药抑制AChE/BChE活性的能力

我们以前报道过利用LAT1的酮洛芬前药是乙酰胆碱酯酶(AChE)的选择性底物，而不是丁酰胆碱酯酶(BChE)[51]。

在本研究中还评估了与AChE和BChE的相互作用。奇怪的是，不仅利用LAT1的前药，而且其母体穿孔素抑制剂都能抑制小鼠脑S9亚细胞部分AChE的活性，其IC50值分别为8和12μM(表3)。此外，所研究的两种化合物均不能抑制BChE的活性。根据Hanes-Woolf图的线性回归，该前药对乙酰硫胆碱的亲和力增加(km130~178nmol/m in M)，反应速度减慢(从2.21nmol/μ/mg蛋白降至2.17nmol/min/mg蛋白)，从而对乙酰胆碱酯酶呈混合型抑制作用(表4)。因此，PFI-Pd与AChE以混合型相互作用，即它是AChE的底物，但也可以与酶的催化活性位点以外的其他位点结合。

表3 穿孔素抑制剂(PFI)及其LAT1利用前药(PFI-PD)对小鼠脑S9亚细胞部分AChE和BChE的抑制作用(IC50值)(Mean±SD，n=3)

表4 LAT1利用前药(PFI-PD)抑制小鼠脑S9亚细胞组分AChE的酶反应动力学参数及hCES1和hCES2介导的PFI-PD生物转化(Mean±SD，n=3)

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利用LAT1的前药通过CES生物转化为母药

此前有报道称，PFI-PD在大鼠肝脏S9亚细胞部分(半衰期约为55分钟)中的生物转化相对较快[24]，而在小鼠脑S9亚细胞部分中更稳定(大约50%的前体药物在5小时孵育期间被生物转化)[25]，并在人血浆中完全稳定[24]。然而，PFIPD在原代小鼠星形胶质细胞匀浆中被生物转化，半衰期约为6小时[26]。由于CES在人和啮齿动物肝脏以及啮齿动物血浆中活性最高，但在人血浆中不存在，因此推测CES可能参与了该前体药物的生物转化。在这项研究中，我们评估了人重组CES1b和CES2生物转化PFI-PD的动力学参数。两种CES都能非常有效地将前药转化为

对其母药的影响(表4)。CES1b对前药的亲和力(Vmax181mol/μ/mg蛋白和Km42μM)高于CES2(Vmax103mol/μ/mg蛋白和Km8μM)。因此，我们得出的结论是，除了AChE，CES很可能还参与了大脑中的生物转化。

穿孔素抑制剂及其利用LAT1前药抑制BACE1的能力

我们之前也曾报道过利用LAT1的阿魏酸衍生物具有多功能特性，可以改善神经炎症和氧化应激[52]。其中包括对BACE1活性的抑制。因此，在本研究中，PFI-PD的能力也与其母药和已知的BACE1抑制剂(KTEEISEVN-Sta-VAEF-NH2；由试剂盒提供)一起进行了评估[38]。出乎意料的是，PFI及其利用LAT1的前药在浓度分别为1和10μM时，对BACE1活性的抑制率分别为71-96%和82.97%(图8)。此外，其抑制效果与已知的BACE1抑制剂相当(0.25μM；抑制率约为86%)。

图8 孵育30分钟后，1或10μM穿孔素抑制剂(PFI)及其LAT1利用前药(PFI-PD)和0.25μM BACE1抑制剂(KTEEISEVN-StA-VAEF-NH_2)[38]对β位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)活性的抑制作用。数据以平均值±标准差(n=3)表示。星号表示与各自对照的差异有统计学意义(*P<0.001，单因素方差分析，紧随其后的是Tukey‘st e s t

讨论

根据本研究的结果，穿孔素抑制剂(PFI)转化为LAT1利用前药(PFI-PD)可以增加小鼠原代星形胶质细胞的摄取和生物利用度。此外，我们以前已经证明，细胞对原代星形胶质细胞的摄取是由LAT1介导的，因为在特定的LAT1抑制剂存在的情况下，摄取被抑制了70%以上[26]。以抑制[14C]-L-亮氨酸摄取为指标，PfI-PD与LAT1结合的能力较强，IC50值为4μM(Ta B L E1)。此外，这与我们之前在人乳腺腺癌细胞(MCF-7)中获得的值1.54μM[53]是一致的。值得注意的是，该前药与星形胶质细胞中LAT1的结合能力远高于已知的LAT1抑制剂，后者的IC50值仅为14μM[37]。此外，这种利用LAT1的前药在原代星形胶质细胞中的转运能力比它的母药大许多倍(图2)，因为这种前药能够在30分钟的孵育过程中自动激活其LAT1介导的摄取[40]。由于在LAT1结合研究(5分钟)中未检测到此机制，因此未来应更彻底地研究此机制。。相比之下，在50 nM的PFI细胞裂解液中未检测到化合物，因此无法计算出Kp、Uu、Cell值。

我们最近报道，除了星形胶质细胞外，包括PFI-PD在内的利用LAT1的前体药物也可以比亲本药物更有效地积聚到神经元和小胶质细胞中，因为这些细胞类型表达LAT1的细胞膜上的LAT1的表达水平相当(3.07-3.77fmol/μ，GP r o t e n)[26]。在本研究中，PFI-PD最重要的特性之一是它不影响小鼠原代星形胶质细胞的细胞活力，而PFI在较高浓度(>200μM)时抑制细胞增殖(图3)。然而，这些浓度比PFI对其靶蛋白穿孔素的IC50值高出200多倍，因此，这些浓度不是图8中1或10μM穿孔素抑制剂(PFI-PD)和0.25μM BACE1抑制剂(KTEEISEVN-StA-VAEF-NH2)[38]对β位点淀粉样前体蛋白(APP)裂解酶1(。数据以平均值±标准差(n=3)表示。表4利用LAT1的前药物(PfI-PD)抑制小鼠脑S9亚细胞组分AChE的酶反应动力学参数和hCES1和hCES2介导的PfI-PD(Mean±SD，n=3)Vmax Km(μM)PfI-Pd(12μM)nmol生物转化的动力学参数(P<0.05，P<0.05)，与相应的对照比较差异有统计学意义(*P<0.05，单因素方差分析，然后是TUKEKM)表4利用LAT1的前药物(PfI-PD)抑制小鼠脑S9亚细胞组分AchE的酶反应动力学参数以及hCES1和hCES2介导的PfI-PD(Mean±SD，n=3)。2.17±0.02 178.7±9.1PFI-PD CES1b 180.9±36.741.8±15.6CES2 103.2±23.98.4±5.8mol/μ与临床相关[54]。此外，在我们之前的文章中，据报道，PFI-PD在星形胶质细胞匀浆中的生物转化率非常慢，几乎是6小时[26]；因此，不可能在大脑中达到如此高的释放母药浓度，从而导致任何毒性效应。再加上前药在这些细胞中相对较高的非特异性蛋白/脂结合(fu，cell=0。0.0 7%)，尽管PFI-PD被更有效地转运到这些细胞内，但其抗增殖作用与其母药相似。而PFI-PD在较低浓度(10-100μM)时能诱导细胞增殖。即使它可能不是密切相关的，但应该记住，前药能够诱导LAT1在质膜上的表达或功能。这也可能增加对必需氨基酸的吸收，这可能会促进细胞生长，这一点应该在未来进行更深入的研究[55，56]。因此，将穿孔素抑制剂转化为LAT1利用和缓释前药可以防止母药可能的毒副作用。

最重要的是，在前药浓度高于50μM的顺铂存在下，PFI-PD能够保持MCF-7乳腺癌细胞的活力，而PFI对顺铂处理的细胞没有明显的影响(图4)。由于顺铂通过caspase-3/-6/-7/8依赖和独立的途径诱导细胞凋亡[42-44]，前药和/或释放的母药对细胞存活的影响很可能是通过直接抑制这些途径介导的，而不涉及细胞毒性caspase激活颗粒酶的释放。此外，这些顺铂逆转效应是浓度依赖的，这意味着增加细胞给药可以改善药理效应。

这项研究还首次证实，通过前药途径增加LAT1介导的大脑对穿孔素抑制剂的摄取，以及随后母药在脑实质细胞[25，26]中的积累和释放，也可以在活体中导致疗效的提高。这一点在LPS诱导的神经炎小鼠模型中得到了证实，在该模型中，前药能够比其母药更有效地减少脑组织中caspase-3/-7的含量(图5)。根据早期的大致相同剂量(23nmol/kg)的药代动力学研究[25]，PFI-PD的脑Cmax为0.12nmol/g组织，相应的无结合Cmax，u值为0.002μ/g组织，而PFI的水平低于LC-MS/MS方法的检测下限。此外，前药治疗后，脑组织中PFI的释放量为0.01nmol/g组织，游离部分为0.004 pmol/g组织。这意味着单用纳摩尔水平的前药或皮摩尔水平释放的母药能够使脑组织caspase-3/-7水平降低40%以上(从117%降至72-74%)。然而，PFI-PD和/或释放的PFI的这些效应是否归因于直接抑制caspase介导的途径，或者是细胞毒效应细胞(CTL和NK细胞)和其他caspase抑制机制，如通过颗粒酶介导的机制，还需要在未来得到更详细的证实。然而，不管其机制如何，已知caspase-3负责神经元和星形胶质细胞的细胞死亡[45]，因此，利用PFI的LAT1前药具有显著的抑制caspase介导的脑神经元和星形胶质细胞凋亡的潜力[29]。

然而，PFI或其前体药物对caspase-3/7产生的影响可以通过几种不同的直接或间接机制介导。氧化应激增加是诱导caspase-3/-7产生的间接机制之一[48]。因此，在本研究中，我们用体外培养的小鼠原代星形胶质细胞和体内LPS诱导的小鼠来评价这些化合物对脂质过氧化的影响。因此，PFI-PD对caspase-3/-7的抑制作用也很可能来源于某些直接或间接的机制，而不是减少大脑中的氧化应激反应(如图6所示)，因此，PFI-PD对caspase-3/-7的抑制作用也很可能来源于某些直接或间接的机制，而不是通过降低脑组织中的氧化应激来实现的。

奇怪的是，PFI-PD和PFI(没有被广泛转运到血脑屏障或靶细胞中)，星形胶质细胞和小胶质细胞(图2)[25]，在LPS诱导后或同时给药时，也能降低脑内PGE2水平(图7)。由于治疗组之间没有显著差异，无论是化合物还是给药间隔，我们假设这种效果可能源于化合物的外围效应。脂多糖不仅可以引起神经炎，也可以引起外周炎症，据报道，外周炎症因子以及炎性细胞，如肥大细胞和T细胞，可以增加神经炎症，因为它们可以渗透到血脑屏障[57，58]。进入大脑后，这些介质可以直接或通过激活胶质细胞发挥作用，首先诱导并维持慢性神经炎。因此，前药既可以在大脑中发挥作用，也可以在外周发挥作用，从而降低整个大脑的PGE2水平，这是很有可能而且非常有益的[30]。此外，据报道，活化的T细胞表达LAT1[55，59，60]，因此，PFI-PD可以很容易地进入这些细胞。不言而喻，任何使用LAT1的前药在药物开发的早期阶段都应该非常仔细地评估其免疫学效果。

除了抑制caspase-3/-7的产生、氧化应激和大脑内的炎症外，PFI-PD还被发现在微摩尔水平上有效地抑制BACE1(图8)。奇怪的是，PFI也能抑制BACE1功能。由于本研究的孵育时间相对较短(30min)，该前药很可能能够以完整的形式抑制BACE1。此外，该前药被认为是AChE的底物(表3)；它似乎与AChE的催化活性位点Mol Neurobiol(CAS)以外的某个位置结合。众所周知，乙酰胆碱酯酶(AChE)也有一个位于CAS[61]附近的外周阴离子位点(PAS)。因此，PFI-PD很可能不仅能与CAS结合，而且还能与AChE的Pas结合。这确实是极有可能的，因为母药也能够以与前药(8μM)相当的亲和力(12μM)抑制AChE。然而，抑制乙酰胆碱酯酶作为乙酰胆碱的竞争性底物或作为释放的母药和作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的正常功能可以有额外的积极作用，特别是在AD患者的大脑中，即患有AChE活性增强的个体[62]。综合本研究的结果，可以认为LAT1-利用穿孔素抑制剂的前体药物，无论是作为完整的前体药物还是通过释放的母药，都是一种脑靶向多功能神经保护化合物。

除了AChE，CES1b和CES2也能够将利用LAT1的PFI-PD转化为PFI(表4)。虽然结果是由纯重组酶获得的，但可以推测，根据较低的Km值和较高的Vmaxv a l u es，tC E S e sa r em o s tl i k e l yt h em a a在生物转换酶中而不是AChE。据报道，CES2表达在血脑屏障的内皮细胞上，理论上可能会限制大脑对前体药物的摄取[63]。然而，据估计，一旦LAT1底物从血液输送到内皮细胞，由于该转运蛋白底物的高度亲和力[64]，它也会通过LAT1迅速穿过腔膜(或基底外侧)进入脑间质液。因此，大多数利用LAT1的前药很可能是在脑实质细胞(大多数水解酶，如CES)所在的脑实质细胞中生物转化为它们的母药，而不是在血脑屏障内皮细胞[65-68]。此外，我们之前已经证明，利用LAT1的酯类前体药物是生物转化的，并在所有表达LAT1的脑细胞类型中释放它们的母药，包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞[26]。在这些细胞匀浆中，PFI-PD的半衰期约为4-6h。不幸的是，CES家族的其他亚型及其在脑内的定位仍然知之甚少。此外，在设计通过CESes进行生物转化的前药时，有必要考虑CES1在肝脏和CES2在肠道中的高表达[69]。此外，在研究前体药物时，应该承认物种的差异，例如，由于人和啮齿动物生物转换酶在全身的表达谱不同，很难在这些物种之间建立可靠的关联[51，70]。

结论

们的母药，包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞[26]。在这些细胞匀浆中，PFI-PD的半衰期约为4-6h。不幸的是，CES家族的其他亚型及其在脑内的定位仍然知之甚少。此外，在设计通过CESes进行生物转化的前药时，有必要考虑CES1在肝脏和CES2在肠道中的高表达[69]。此外，在研究前体药物时，应该承认物种的差异，例如，由于人和啮齿动物生物转换酶在全身的表达谱不同，很难在这些物种之间建立可靠的关联[51，70]。

结论

总之，本研究首次证明，通过利用LAT1改善穿孔素抑制剂的脑部药物输送，以及在大脑实质细胞中更高的积累和生物利用度，这可以导致改善的药理效应，例如减少细胞凋亡介质(即caspase-3/-7)的产生。此外，利用穿孔素抑制剂的LAT1前体药物可以同时具有直接或间接的多功能特性，因为所研究的前体药物还能够减少大脑内的整体氧化应激和炎症，可能还可以降低外周的氧化应激和炎症。此外，它还抑制特定的酶，如BACE1和AChE，无论是以完整的前药形式还是作为释放的母药。因此，本研究表明，利用LAT1改善穿孔素抑制剂的脑内药物转运，进而提高细胞存活，降低氧化应激和炎症，是进一步开发抗阿尔茨海默病等神经退行性疾病药物的可行方法。