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TGN/EE介导的囊泡运输与GDI1协同调控根毛中ROP2 GTPase的动态定位的机理研究

【摘要】：根毛是根表皮细胞凸起形成的管状结构,是植物吸收水分和无机盐的主要部位,其形态的维持对植物的生长发育及响应外界胁迫具有重要意义。由于根毛培养周期较短,便于细胞学观察,与病原菌存在互作关系,并且是快速生长的极性细胞,而成为优良的研究系统。在此我们以根毛为研究体系,探索小G蛋白ROPs (Rho-related GTPases from plant)极性定位的调控机制。已有研究表明植物细胞极性生长的维持依赖于活性ROPs的时空特异性定位。ROPs是植物中一类重要的小G蛋白,在植物生长发育、激素信号转导、抗逆和抗病过程中起重要的调控作用。ROPs具有“分子开关”的作用,分为GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式,调控其形式转变的作用因子分为三类,鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins, GAPs)和鸟苷酸解离抑制因子(guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs)。其中GEF和GAP调控机理的研究相对清晰,GEF使非活性形式的ROPs转化为活性形式的ROPs,而GAP使活性形式的ROPs转化为非活性形式。目前关于GDI调控ROP的机制研究并不是很清晰,且主要集中于GDI从质膜上移除ROP进入胞质的负调控作用。然而,利用动物以及酵母系统进行的研究表明,GDI除了这种负调控外,还负责将Rho从内质网膜转运到质膜上,即对其定位具有正调控作用。植物中的GDI是否有类似的功能还不清楚。此外,动物及酵母Rho靶向质膜的途径除了GDI参与外,还通过特定的囊泡运输途径介导。这一方面在植物细胞系统中还尚未有报道。本研究旨在揭示GDI及囊泡运输对根毛中重要的小G蛋白ROP2动态定位的调控作用。研究结果和主要结论如下：(1)根毛中GD11调控ROP2的顶端质膜定位GD1l功能缺失突变体scnl-1根毛中ROP2的顶端极性定位发生紊乱,造成根毛的多个起始。我们利用CITRINE-TUBBY-C标记scnl-1突变体中phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate (PIP2)的定位,结果发现在scn1-1突变体根毛中确实存在多个PIP2聚集的生长点,并且PIP2在根毛顶端的分布范围扩大,暗示GDIl功能丧失干扰了单一顶端的形成和维持。为了研究GDI1是否介导ROP2靶向质膜的过程,我们通过荧光漂白恢复实验(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)对野生型和scnl-1突变体根毛顶端质膜上GFP-ROP的定位进行研究,在野生型根毛顶端质膜上的GFP-ROP被漂白后能够快速恢复,在scnl-1突变体中GFP-ROP的恢复速度明显慢于野生型。说明GDI1对于ROP2靶向质膜的过程具有关键作用。(2)反式高尔基网络(TGN/EE, trans-Golgi network/early endosomes)介导的囊泡运输参与调控ROP2的动态定位。为了探究ROP在根毛顶端质膜的极性定位是否还依赖于囊泡运输途径的调控,我们结合遗传学和药剂学的手段,阻断特定的囊泡运输途径,分析ROP的动态定位。我们的结果表明ROP2的动态定位依赖于ARF1 (ADP-ribosylation factorl),布雷菲德菌素A(brefeldin A, BFA)敏感的高尔基后囊泡运输途径。高尔基后囊泡运输途径又分为两条,包括衔接蛋白API (Adaptin Protein 1)介导的在TGN/EE上进行的外排途径和RabA4b介导的外排途径。我们进一步的研究结果表明AP1介导的TGN/EE上的外排途径参与ROP靶向质膜的过程。并且ROP2的动态定位不依赖于RAB5调控的液泡降解途径。(3) FRAP实验表明GDI1和囊泡运输共同调控ROP2顶端质膜的动态定位我们利用BFA处理及ARF1-DN (dominant-negative)干扰外排运输途径,发现在根毛顶端质膜定位的GFP-ROP2漂白后恢复速度与野生型的恢复速度没有明显区别。但是将ARF1-DN通过杂交引入到scnl-1突变体或用BFA处理scnl-1突变体,与Scnl-1突变体相比GFP-ROP2漂白后的恢复速度显著降低了,暗示GDI1对ROP2的顶端质膜定位具有关键的调控作用,而囊泡运输同样参与调控ROP2的动态定位。结论：GDI1和囊泡运输协调控制根毛的极性生长。我们发现GDI1对ROP2在根毛极性生长过程中的动态定位具有快速调控的作用,且控制根毛单一极性生长点的建立与维持。而囊泡运输途径受到GDI1途径的影响,主要在根毛的快速生长中起调控作用。这些结果证明GDI1与TGN/EE介导的囊泡运输这两条途径决定了ROP在根毛极性生长过程中动态的顶端定位,以保证根毛的极性建立、极性维持和快速生长。