多重共线性和自相关的区别_多重荧光免疫组化技术

组织化学术（histochemistry）是应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术，与组织学技术相结合而产生的技术。此技术能在组织切片上定性、定位地显示某种物质的存在与否以及分布状态。该技术应用于游离细胞的样品（如细胞涂片）则称之为细胞化学术（cytochemistry）。

组织化学术主要分为三种。即一般组织化学术（如PAS反应^[1]）、免疫组织化学术（immunohistochemistry）和原位杂交术（in situ hybridization）。

免疫组化技术是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫治疗的崛起，越来越多肿瘤微环境中的标志物被发现与疾病治疗、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求。

本文主要介绍一种多重荧光免疫组化技术。

免疫组织化学术原理示意图

多标记免疫荧光和传统免疫荧光的区别

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• 多重荧光免疫组化——酪胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术

TSA技术是一类利用辣根过氧化酶^[2]（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。类似常规免疫组化的DAB显色法^[3]，TSA（Tyramide signal amplification）技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

酪胺信号放大技术原理

多重荧光免疫组化染色流程图

• 同种属⼀抗在同⼀样本中的多⾊荧光标记⼀直是难题。TSA技术利⽤荧光化合物的热稳定性，采⽤微波煮沸的⽅式将附着在样本上的<⼀抗-⼆抗-HRP>复合物变性和解离，⽽荧光化合物则始终结合在样本原位。在下⼀轮TSA荧光标记过程中，新的<⼀抗-⼆抗-HRP>复合物将新的荧光化合物结合在样本原位。通过N轮重复的“标记➛抗体解离”步骤则能标记N种荧光。
• 荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。
• 使用TSA技术，你需要准备：

1. 严格验证的高特异性抗体
2. HRP偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗
3. 酪胺荧光素
4. 多光谱成像系统

参考

1. ^ 一种检测糖类存在的化学反应。带有邻位羟基的单糖，经过碘酸氧化产生的醛基，与碱性品红反应，可显现红色。
2. ^过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。
3. ^二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物。