1、仪器组成:
1.1各台HP1100系列高效液相色谱仪大致组成如下:溶剂瓶及安放箱、真空在线脱气机、高压输液泵、柱温箱、VWD检测器、进样装置、计算机工作站及其外设。
2、准备工作:
2.1根据个人实验需要配好动相流(不少于200ml)并用微孔滤膜滤过,其中的两台高效液相色谱仪为单元泵,需事先超声15分钟左右进行脱气处理。
2.2一般将水相置于棕色瓶A中(因水相在见光条件下容易滋生细菌),有机相置于其它瓶中。
3、启动仪器:
3.1打开计算机,启动电脑至桌面后,将CAG Bootp Server窗口最大化。
3.2依次打开HP1100系列高效液相色谱仪的真空在线脱气机、高压输液泵、柱温箱、VWD检测器的电源开关。
3.3等待3至5分钟,至HP1100各部件自检完毕,并且CAG Bootp Server窗口接收到1100传来的7行联通完毕的信息后,将CAG Bootp Server窗口最小化,双击桌面上的instrument1 online图标启动化学工作站。
4、建立新方法:
4.1启动化学工作站后,左键单击View菜单,选择Method and Run Control,进入Method and Run Control界面(界面上有泵、柱温箱检测等的示意图标)。
4.2单击Method菜单,选择Edit entire Method选项,进入方法编辑窗口。
4.3遵照设置向导依次进入:Edit method:Instrument1窗口,不必修改,按OK按钮;进入Method information: Instrument1窗口,输入对本方法的说明文字,按OK按钮;进入Setup Pump:Instrument1窗口,在Control-flow后输入流动相流速,在Control-stoptime后输入样品运行时间长度,在Control-posttime后输入需要平衡液相柱的时间长度,在Solvents项下输入各瓶中流动相的比例,如果要进行梯度洗脱,在Timetable项下设置梯度洗脱的程序菜单,按OK按钮;进入VWD signal:Instrument1窗口,在Sigal-wavelenth后输入所用检测波长,在Time-stoptime后输入记录谱图信号时间长度,按OK按钮;进入Signal Details: Instrument1窗口,不必修改,按OK按钮;进入Edit integration events窗口,设定参照(6、谱图的优化),按OK按钮;进入Specify Report: Instrument1窗口,设定参照(7、报告的打印),按OK按钮;进入Instrument Curves: Instrument1窗口,不必修改,按OK按钮;进入Run Time Checklist: Instrument1窗口,选中Data Acquisition前的方框,按OK按钮,完成整个方法的编辑。
4.4单击Method菜单,选择Save Method As…选项,命名为自己的方法后保存。
注:在Method and Run Control窗口下,依次左键单击泵、柱温箱、检测器等示意图标,在弹出的快捷菜单中选择Set up项,也可以进行方法的编辑。但最后一定要按4.4操作,将方法另存,以防覆盖了别人设定好的方法。此快捷操作在样品测定时实时对方法进行修改很有用处。另如果自己的方法已经存在,单击Method菜单,选择Load Method …选项可以进行调用而不必重新编辑。
5、运行样品:
5.1方法建立好后,先观察输液管中有无气泡,如有汽泡,要先进行排出气泡的操作:手动逆时针旋转Purge阀二至三圈,将Purge阀打开,将泵流量设为5ml/min(左键单击泵图标,在弹出的快捷菜单中选择Setup Pump,在Setup Pump:Instrument1窗口下将Flow项下的值改5。),打开泵(左键单击泵图标,在弹出的快捷菜单中选择Control…,在Control Pump:Instrument1窗口点中On。)至废液管中无气泡,将泵流量改为原来的值,顺时针旋转Purge阀,将Purge阀关紧。
5.2单击Istrument菜单,选择System On项(或单击系统图标右下方on按钮),将泵、柱温箱、检测器打开。
5.3单击View菜单,单击Online Signals,选择Signal Window1,在打开的窗口中可以看到采集的信号。
5.4等待Online Plot信息窗口中基线平稳后,单击RunControl菜单,选择Sample Info…,在Sample Info :Instrument1窗口中输入操作者姓名,存盘文件名及样品参数。编辑完成后按Ok按钮退出。
5.5单击line Plot信息窗口中Balance按钮,等待窗口提示Ready后,即可进行进样分析。
5.6进样后,检测器同时开始记录数据,当时间至设定的StopTime,仪器自动停止测定并显示谱图。
6、谱图的优化
6.1左键单击View菜单,选择Data Analysis,进入Data Analysis窗口。
6.2左键单击File菜单,选择Load Signal,进入Load Signal:Instrument1窗口,在D:\Data\…下找到自己的文件,按OK按钮,即可看到自己的谱图全貌。
6.3左键单击Integration菜单,选择Integration Events…,在所显示的窗口左边有一个积分参数表,有Slope Sensitivity(斜率),Peak Width(峰宽), Area Reject(面积拒绝值),Height Reject(峰高拒绝值),Shoulder(肩峰)等项,根据个人需要进行修改,修改完毕后,点击表上方一排快捷图标中倒数第二个快捷图标,系统提示:是否保存对积分参数表的修改,单击Yes按钮,即可看到优化后的谱图全貌。
7、报告的打印
7.1重复6.1及6.2操作,调出需要打印的谱图。
7.2左键单击Report菜单,选择Specify Report…,进入Specify Report:,Instrument1窗口,对报告的格式进行定义。在Destination框中,依次选中Printer,File和TXT前面的方框;在Report Style框中,从Style后的下拉框中选择Detail(报告中提供保留时间、峰高、峰面积、峰面积百分比等参数)或Performance(报告中提供分离因子、对称性、塔板数、分离度等参数);在Chromatogram Output框中Size项下调节谱图所占页面的比例。最后点击Ok按钮退出。
7.3左键单击File菜单,选择Print Preview,进行打印报告的预览。
7.4左键单击File菜单,选择Print,进行报告的打印。
8、冲柱及关机
8.1 实验完毕后,要冲洗色谱柱:先关闭检测器(左键单击检测器图标,在弹出的快捷菜单中选择Control…,在Control VWD:Instrument1窗口点中Off),并让泵暂停(左键单击泵图标,在弹出的快捷菜单中选择Control…,在Control Pump:Instrument1窗口选Standby),然后将棕色瓶A更换为盛有80%甲醇或80%乙腈的自备瓶,打开泵(左键单击泵图标,在弹出的快捷菜单中选择Control…,在Control Pump:Instrument1窗口点中On),并左键单击泵图标,在弹出的快捷菜单中选择Setup Pump,在Setup Pump:Instrument1窗口下将Solvent项下A瓶流动相的比例改为100%,点击Ok按钮退出。让系统运行30~40分钟,即可按下面的操作关机。
8.2左键单击File菜单,选择Exit,退出化学工作站。
8.3单击Instrument菜单,选择System Off项(或单击系统图标右下方off按钮),将泵、柱温箱等关闭。
8.4关闭CAG Bootp Server窗口,并关闭电脑。
8.3依次关闭HP1100系列色谱仪VWD检测器、柱温箱、高压输液泵、真空在线脱气机电源。
8.5填写使用登记。
注意:当泵系统图标中溶剂瓶标志变黄时,要及时添加溶剂,否则仪器在溶剂量小于0.15L会自动停止运行。添加溶剂后,左键单击溶剂瓶图标,在弹出的快捷菜单中选择Solvent bottle Filling…项,在 Solvent bottle Filling:Instrument1窗口中的Actual Volume下输入各瓶中实际溶剂量。