综述——通过斑马鱼的密集脑回路重建来理解神经计算

密集脑回路重建的目标与挑战

神经元之间的突触连接是神经元回路功能的最基本决定因素之一。在学习的过程中，通常认为经验驱动的突触连接修改能够将信息存储在连接模式（接线图）中，以优化对未来输入的响应。因此，对突触分辨率下神经元连接的详细分析对于理解神经元的计算和记忆过程是至关重要的。但即使在小回路中，可能的连接模式空间也是天文数字：在由N个神经元组成的二元连接网络中，当神经元的数量超过17时，可能的接线图数量超过了宇宙中的原子数量。这个简单的数字游戏不仅显示了网络连接作为信息处理和记忆资源的潜力，也强调了在不了解真实接线图的情况下模拟生物现实网络的主要问题。最近的体电子显微镜（vEM）和自动图像分析技术发展使得通过在高密度下重建大量神经元群体及其突触连接来实验确定接线图成为可能。这些方法可以与同一组神经元的活动测量相结合，例如在使用vEM之前通过钙成像观测神经活动（如图1a所示）。我们将这种方法称为动态连接组学，因为它可以在神经元群体活动的动态和潜在的连接性之间建立直接关系。斑马鱼是一种有吸引力的脊椎动物动态连接学模式生物，因为它的小大脑为大规模光学活性测量和密集电路重建提供了重要优势。

图1  动态连接组学。 （a）动态连接组学工作流。 （b）连通性的密集和稀疏采样。 （c）成年斑马鱼溴球中四个神经元的体积重建解剖结构，包括概览（左）、子区域的放大（中）和原始电子显微镜图像数据（右）。

自从高尔基（Golgi）和拉蒙·卡哈尔（Ramón y Cajal）的开创性工作以来，大多数高分辨率的神经解剖学方法都依赖于稀疏的神经元标记和成像。但这些方法对于神经元接线图的重建具有根本性的局限性。其它映射神经元连接的方法，例如可视化定义神经元类型之间突触连接的分子方法和追踪单突触连接神经元的方法也缺乏这种解析高阶网络结构的能力（如图1b所示）。

神经科学中的基本概念通常假设更高的大脑功能和记忆依赖于功能定义的神经元集合之间的联系。然而，如果没有密集回路重建，许多概念都难以用实验验证。因此，动态连接组学在解决各种基本问题方面具有独特的能力。

本文对斑马鱼的动态连接学方法进行了综述，且特别讨论了“没有神经元连接的密集重建，就不可能获得对神经元的计算”的见解。

斑马鱼动态连接组学对神经元计算的启示

前顶盖运动选择性的组合逻辑

前顶盖内神经元（包括OKR和OMR）在视觉运动转换中起着关键作用，因为它们能够提取关于视觉流动模式的重要信息。综合分析确认了对两只眼睛中不同的、非随机的运动方向组合有反应的前盖神经元类别。这些类别中的一个子集被归类为单眼，因为它们的反应仅取决于对侧眼睛的输入。这些神经元将神经突起延伸到AF5，这表明它们接受视网膜中方向选择性神经节细胞的直接输入。相反，双眼前顶盖内神经元整合双眼的输入，而不投射至AF5。遵循简约的原则，假想的接线图已经被提出，用来解释不同类别的单眼和双眼前顶盖内神经元的功能特性。由于被提出的连接性的复杂性，加上前顶盖组织尚未被实际探测和遗传标记的缺乏，使得通过稀疏连接性方案对接线图进行实验测试变得困难。要从机制上理解前顶盖的光流过程，一个直接的方法是重建前顶盖内神经元功能特征群体之间的连通性。这种方法需要对中线上的神经元进行远程追踪，以确定双眼神经元对双眼信息的整合，因为视网膜神经节细胞的投射100%是旁系的。为了解决这个问题，前顶盖内神经元的形态和突触连接将会被重建在大量的EM图像中，这些图像是在测量双眼神经元胞体对全场运动的反应后得到的。前顶盖内神经元（包括大量越过中线的神经元）及其突触的功能特征是手工注释的（如图2所示）。这种方法可以通过搜索特定类型神经元之间的预测连接，来直接测试当前前顶盖运动过程的模型。

侧线机械感觉器官的方向选择性连接

侧线由分散的机械感受器官——神经丘组成，其毛细胞与内耳毛细胞相似。单个毛细胞具有方向选择性，优先对嘴或尾方向的水运动做出反应，并与向大脑传递信息的传入轴突末端形成突触。每个传入轴突末端只接受来自相同方向偏好的毛细胞的输入。单个毛细胞支配不止一个轴突末梢，神经丘在接受多数毛细胞输入的每个方向上，都包含了一个占主导地位的轴突末梢。进一步研究表明，极性特异性连接的发展是独立于行为的，它由毛细胞的特性所决定，而毛细胞的特性是由Notch信号建立的。这些对神经丘微电路的观察需要同时对多个毛细胞和轴突末梢之间的连接进行重建和活动监测。

图2  斑马鱼幼体脑神经元的重建

速度相关的运动回路接线特性

鱼在快速游泳时，从头到尾剧烈的肌肉收缩频率很高；而当其慢速游泳时，肌肉收缩力度较小，频率较低。这些有节奏的肌肉收缩动作在尾巴的左右两侧交替进行，并由脊髓中称为中枢模式发生器（CPG）的神经回路控制。随着收缩强度需求的增加，CPG的运动神经元（MN）招募到更多更大的神经元，允许尾部肌肉系统更强的收缩。MN有规律的兴奋是由外周下行兴奋性中枢神经元（CiDs）提供的。在缓慢游泳过程中，只有腹侧的CiD处于活动状态。随着游泳速度的增加，CiD的活动向背部转移，腹侧CiD逐渐失活。MN的有序招募可能是它尺寸依赖的生物物理性质。另外，CPG可以通过MN与CiD之间特定的接线模式来选择性地招募MN子集。为了探讨MN募集的连线特异性，研究人员获取了一个完整的斑马鱼幼体脊髓半节段的连续块面电子显微堆栈，并重建了MN和CiD回路的接线图。尽管小的MN看起来似乎并不成熟，且几乎不接受突触输入，但是中等及大号MN确实受到了不同程度的神经支配。小号和中等大小的MN都接受腹侧CiD的输入，只有大的MN接受背部的CiD输入。因此，大号MN仅仅在快速游泳时被背部的CiD招募。相反，在缓慢游泳时，背部的CiD和MN均处于非活动状态，腹侧CiD根据大小和兴奋性来招募小MN和中等MN。在快速游泳过程中，腹侧CiD失活机制仍有待研究。

一种基于时间整合控制眼位的脑干运动模块

眼球运动系统对眼睛位置的控制是视觉的重要组成部分。眼睛位置信号起源于前置运动速度-位置神经积分器（VPNI）回路，该回路将角速度命令信号临时集成到角位置命令中。整合神经元之间的群体活动位于一个低维流形上，该流形由眼睛的角度位置进行参数化，类似于用作运动控制，记忆和决策的其它回路的动力学。因为这类系统适合短期记忆功能，所以引起了研究者广泛的兴趣，但是其潜在机制尚未被很好地理解。

有研究人员从斑马鱼幼虫的脑干中获得了一个大型连续切片的电子显微镜堆栈，该区域包含了关键外周MN集群和许多动眼中枢神经元。使用先进的自动分割方法，他们确定了约3000个节点之间的突触连接，每个节点代表神经元的全部或部分重建。根据连接性矩阵，他们计算了特征中心度，该特征中心度衡量了图中节点的相对影响力，并将特征中心度高的节点定义为图的中心。这些节点是循环连接的，预计会对神经元群体活动的动态产生强大的影响。向中心提供输入或从中心接收输出的其他节点被看作是外周的。使用图聚类方法的进一步分析表明，这个中心被组织成两个模块，每个模块内的密度都大于模块间的连接性。在一组(轴向模块)中，细胞连接的重复性较弱，并与外周的脊髓投射神经元形成突触。在另一组(动眼模块)，细胞有更密集的重复性连接，并投射到外周的眼外MN。与同龄同物种的钙成像数据相比，具有动眼运动功能特征的神经元与动眼运动模块关联的可能性是与轴向模块关联可能性的两倍。

动眼运动模块的循环连接和外周连接与提出的VPNI计算模型是一致的。为了进一步验证动眼运动模块与VPNI相对应的假设，有研究者建立了一个直接结合来自重建连接体的突触连接模型。该模型成功地预测了积分神经元的特征协调特性。对脑干神经连接体的密集重建，以及网络分析和功能可视化，揭示了一个复杂的神经元间连接网络，这与神经整合器的功能是一致的。现在，研究斑马鱼脑干动眼神经模块的结构特征是否可以推广到其他执行时间整合和短期记忆的回路将变得十分有趣。

 

总结与展望

vEM数据的自动获取和分析方法已经实现了从单个神经元的稀疏重建到整个网络的密集重建的转变。这种能力从根本上为分析神经元计算和测试学习、抽象化和认知的机械模型提供了新的机会。虽然精确的接线图知识至关重要，但如果没有额外的信息，仅有接线图是不足以理解回路功能的。我们认为，密集电路重建与群体活动监测--动态连接学--的结合特别有用，因为它可以在单个神经元的突触输入和它们的输出之间，以及在网络的高阶结构和它的动力学之间提供直接的联系。

vEM数据不仅对接线图重建很重要，而且还包含其他有价值的信息(图1c)。例如，整个神经元的超微结构重建可以帮助全面分析沿神经轴突的突触分布，而大脑区域的密集重建可以识别新的稀有细胞类型。神经轴突和突触的超微结构可能提供有关突触权重和其他功能特性的信息，而探索细胞超微结构如何与基因表达相关联也将十分有趣。

斑马鱼在动态连接方面的一个特别优势是它们的体积很小，这使得跨大脑区域的神经元连接能够被重建（如图2b所示）。较小的大脑还有助于多个个体等效回路的重建，这对探索接线图的个体差异及其通过特定经验进行的修改都非常重要。即使在成年斑马鱼中，利用现有技术重建整个大脑区域，例如不同的前脑区域，也是可行的。因此，未来动态连接组学在斑马鱼的应用可能会解决更广泛的问题。在斑马鱼幼虫中，确定跨脑区神经连通性的能力可以用来精确定位感觉-运动转换背后的神经回路。一般来说，动态连接组学具有独特的潜力，可以通过依赖经验的突触连接修改来确定信息是如何存储在连线图中的，并且能够探索计算策略（如预测处理）的神经元实现。这个挑战可能在成年斑马鱼身上得以解决，它提供了分析复杂行为（包括联想学习）的能力。因此，斑马鱼动态连接组学是探索高级大脑功能和认知背后的神经元计算机制的一种很有前途的方法。

参考文献

1.         Friedrich, R.W. & Wanner, A.A. Dense Circuit Reconstruction to Understand Neuronal Computation: Focus on Zebrafish. Annu Rev Neurosci 44, 275-293 (2021).

2.         Vishwanathan, A. et al. Electron Microscopic Reconstruction of Functionally Identified Cells in a Neural Integrator. Curr Biol 27, 2137-2147.e2133 (2017).

3.         Vishwanathan, A. et al. Modularity and neural coding from a brainstem synaptic wiring diagram. (2020).