DNA甲基化芯片探针的P值如何计算

illumina 的DNA甲基化芯片，内置了control 探针，用于检测降噪，归一化等各种用途。

以450K  为例, control 探针共有以下15种类型，每种类型的探针都有不同的用途

> unique(IlluminaHumanMethylation450kmanifest@data$TypeControl[[2]])
[1] "STAINING"                "EXTENSION"              [3] "HYBRIDIZATION"           "TARGET REMOVAL"         [5] "BISULFITE CONVERSION I"  "BISULFITE CONVERSION II"[7] "SPECIFICITY I"           "SPECIFICITY II"         [9] "NON-POLYMORPHIC"         "NEGATIVE"               [11] "RESTORATION"             "NORM_A"                 [13] "NORM_G"                  "NORM_C"                 [15] "NORM_T"

在这些control探针中， NEGATIVE探针用于计算探针的P值。

minfi 中计算探针P值的过程如下：

探针的P值  =  1 - P(intensity)

假设探针的信号强度服从正态分布，首先要计算出该正态分布的期望和方差。
由于I 型探针和II 型探针的技术原理不同，所以两种探针是分开计算的。

首先根据negative 探针的信号强度，分别计算红绿两种通道的均值和方差

# 获取negative 探针的IDcontrolIdx <- getControlAddress(rgSet, controlType = "NEGATIVE")   

# 计算红色荧光通道的均值和标准差r <- getRed(rgSet)
rBg <- r[controlIdx,,drop=FALSE]
rMu <- matrixStats::colMedians(rBg)
rSd <- matrixStats::colMads(rBg)# 计算绿色荧光通道的均值和标准差g <- getGreen(rgSet)
gBg <- g[controlIdx,,drop=FALSE]
gMu <- matrixStats::colMedians(gBg)
gSd <- matrixStats::colMads(gBg)# 这里用了中位数代替了算数平均值

I 型探针

I 型探针发出的是单色荧光，可能是红色也可能是绿色，所以红色和绿色也是单独计算的。

对于红色荧光的I 型探针而言，其正态分布的均值等于negative 探针红色荧光通道的均值，标准差对应negative 红色荧光通道的方差

TypeI.Red <- getProbeInfo(rgSet, type = "I-Red")
intensity <- r[TypeI.Red$AddressA, i] + r[TypeI.Red$AddressB, i]
detP[TypeI.Red$Name, i] <- 1-pnorm(intensity, mean=rMu[i]*2, sd=rSd[i]*2)

对于绿色荧光的I 型探针而言，其正态分布的均值对应negative 绿荧光通道的均值，标准差对应negative 绿色荧光通道的方差

TypeI.Green <- getProbeInfo(rgSet, type = "I-Green")
intensity <- g[TypeI.Green$AddressA, i] + g[TypeI.Green$AddressB, i]
detP[TypeI.Green$Name, i] <- 1-pnorm(intensity, mean=gMu[i]*2, sd=gSd[i]*2)

I 型探针

II 型探针是双色荧光，其正态分布的均值对应negative探针红色荧光和绿色荧光的中位数之和，标准差对应红色荧光和绿色荧光的标准差之和

TypeII <- getProbeInfo(rgSet, type = "II")
intensity <- r[TypeII$AddressA, i] + g[TypeII$AddressA, i]
detP[TypeII$Name, i] <- 1-pnorm(intensity, mean=rMu[i]+gMu[i], sd=rSd[i]+gSd[i])

NEGATIVE探针是一系列质量差的探针信号，假设其分布是一个正态分布。
在某个样本中，某个探针检测到的信号强度为 intensity，这个intensity 可能是一个质量差的信号，也可能是一个质量高的信号。

该探针检测到的信号质量可靠记为事件A, 质量不可靠记为事件B, 很显然 P(A）+ P(B) = 1。

探针的P值代表这个探针的信号质量可靠的概率，所以在计算时，只需要用1减去不可靠的概率就行了。

在计算不可靠的概率时，由于I型探针和II 型探针的技术原理，共分成3个正态分布来计算概率。以上就是minfi计算探针P值的详细过程。

计算出探针的P值之后，就可以根据p值进行过滤了。从计算过程也可以看出，P值越小，探针质量越高。