以下内容来自：实验室自建肿瘤全景变异检测性能确认中国专家共识（2024版）
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实验室自建检测对于医疗机构开展未经国家药品监督管理局审批且急需满足临床实践需求的检测具有重要意义。随着近年来肿瘤精准医学的发展，全景变异检测（CGP）已经成为肿瘤患者精准分子分型、靶向治疗、免疫治疗生物标志物等检测的重要手段和方法，但其在医疗机构开展自建检测的标准与应用规范尚缺乏统一的认识与共识。中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组联合中华医学会病理学分会分子病理学组发起了医疗机构开展CGP二代测序（NGS）检测性能确认相关规范中国专家共识，结合中国临床实践，参考国内外文献，从实验室自建的背景、性能确认的场景、评估指标与变异范围，性能确认覆盖的样本类型、数量、临床性能与药效判定，性能确认的场地、人员、质控、室间质评与文档管理等方面进行评述，经专家组讨论并形成12条专家共识，为中国医疗机构开展肿瘤CGP NGS检测的性能确认和临床应用提供参考，以促进医疗机构自建检测应用的发展。
【关键词】恶性肿瘤；实验室自建检测；肿瘤全景变异检测；性能确认；二代测序
随着精准医疗概念的提出，肿瘤精准治疗新方案的不断涌现，新技术和新项目层出不穷，对肿瘤分子病理检测提出更多挑战。传统体外诊断产品由于审批流程复杂，无法完全满足快速发展的临床检测需求。2021年国务院发布《医疗器械监督管理条例》（国务院令第739号）第53条指出，对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。该条文的提出，对于尚未获得国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批准上市、无同类同种产品的体外诊断试剂的实验室自行研发以及在符合资质的实验室开展相应检测提供了政策支持。
美国在1976年首次提出对实验室自建检测项目/试剂（laboratory developed test，LDT）采用实验室自我管理模式，1988年美国国会通过了临床实验室改进修正法案（clinical laboratory improvement amendments，CLIA），明确允许临床实验室按照CLIA要求，发展实验室内部的LDT。
我国在2000年《医疗器械监督管理条例》（国务院令第276号）第十条规定中提出，医疗机构根据本单位的临床需要，可以研制医疗器械，在执业医师指导下在本单位使用。尽管2014年《医疗器械监督管理条例》（国务院令第650号）及后续版本均删除了该条款，但并没有明确禁止医疗机构自制医疗器械。基于目前自研试剂的开发和检测的背景，不论何种场景均需要展开技术性能确认工作，保证整套自研试剂与检测流程与方法学的各项性能参数指标。
当前，国内各地正在积极尝试推动实验室自建自研体外诊断试剂的试点工作，如2023年1月，NMPA综合司、国家卫生健康委员会办公厅联合印发《关于开展医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点工作的通知》，相关试点医院可根据本单位临床需求，自行研制、使用国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，并在执业医师指导下在本医院内使用。2023年3月上海市药品监督管理局和上海市卫生健康委员会制定了《上海市医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点方案》，经报NMPA同意，决定在上海的4家医疗机构开展自行研制使用体外诊断试剂试点。上述最新的医疗机构自建检测和自研试剂的试点方案为我国医疗机构开展自研试剂与自建检测提供了系统的指导性原则与方案。
考虑到肿瘤精准检测与治疗的复杂性以及肿瘤分子标志物日新月异的检测需求，多篇国内外指南和临床实践推荐晚期肿瘤患者开展全景变异检测的二代测序（comprehensive genomic profiling next generation sequencing，CGP NGS）检测。CGP NGS一般覆盖多达几百个肿瘤相关基因的全部外显子区域，检测常见基因变异类型，包括点突变（single nucleotide variant，SNV）、插入缺失（insertion/deletion，Indel）、拷贝数变异（copy number variation， CNV）和基因重排。同时，CGP NGS检测也包含重要的疾病疗效预测/预后相关生物标志物，如肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）状态、同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）等。
与传统单基因检测方法如荧光原位杂交、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、一代测序（Sanger测序）或靶向NGS小Panel相比，CGP NGS通过平行检测更多标志物，节省了临床样本、检测时间和检测成本，最大程度满足晚期或复发肿瘤患者的精准诊疗检测需求。
近年来，CGP NGS检测逐渐被行业和监管机构认可，肿瘤CGP NGS检测产品在国内的注册也备受关注。尽管目前我国CGP NGS检测仍存在院外中心实验室送检的模式，但医疗机构自行开展肿瘤CGP NGS检测必将成为未来的趋势。相比院外检测，在医院内开展肿瘤CGP NGS检测具有以下优势：（1）强监管，医院严格的质量管理体系以及公益性能确保结果的准确性，以及临床样本和数据的安全性；（2）更快的报告时间，结合临床病史实现肿瘤治疗快速决策；（3）有利于人才队伍建设和科研成果转化，能够加强病理科对技术和数据的完整运用，同时可以促进多科室之间更快捷、深入的交流。
我国医疗机构开展的CGP NGS检测主要包括2大类，分别是“未经NMPA批准的商品化试剂盒”和“实验室自行设计研制的NGS检测”，其中商品化试剂盒的检测模式在医疗机构实验室应用较为广泛。在实验室开展常规CGP NGS检测前，进行产品的性能确认是一个必不可少的步骤。与获批的体外诊断试剂开展的性能验证不同，针对实验室自建自研检测或未获得NMPA体外诊断批准的商品化试剂盒的性能确认，需要在正式开展检测前完成检测流程确认，明确质控标准，建立标准操作程序（standard operating procedure， SOP），并且在仪器或关键试剂更换、检测样品类型变化时重新进行性能确认。在我国医疗机构开展CGP NGS的性能确认主要针对目前肿瘤分子检测临床实践中重点关注的问题，如靶向药治疗靶点检测、免疫治疗的疗效预测指标如TMB、MSI，PARP抑制剂治疗疗效预测指标HRD等，针对以上检测的变异位点与生物标志物指标，在实验室自研自建检测体系的性能确认过程中应针对代表性变异位点以及生物标志物（如TMB）等展开技术性能确认，通过精准度、准确性、敏感性、特异性等指标评估CGP NGS的性能参数，确保临床检测实践开展的准确性等临床性能指标。
虽然欧美等国家已经提供了较丰富的实验室自建检测相关的指南和建议，但我国临床检测的实际情况与欧美国家存在诸多不同。我国的CGP NGS检测对医院病理科有更高的要求，包括场地、人员、操作流程等。尽管部分医院已各自积累了丰富的CGP NGS实践经验，然而CGP NGS检测仍急需相关总结并规范，从而发挥示范指导效应。
基于上述背景，由中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组联合中华医学会病理学分会分子病理学组发起了我国医疗机构开展CGP NGS检测的性能确认项目。本项目将重点关注我国医疗机构实验室自建CGP NGS检测的性能确认，提出相关专家建议以及推荐的技术方案。建议和方案应在保证严谨的前提下，具有现实指导性、可执行和可复制性（项目成本投入和周期可控）。本建议围绕覆盖范围更全面的CGP NGS检测项目，对其他肿瘤进行NGS检测，如实验室自建热点NGS检测等也具有参考借鉴价值。对于目前尚未获得NMPA批准上市的NGS中、小Panel，除了复杂基因组生物标志物如TMB、MSI、HRD等，该技术性能确认专家共识从场地、人员、评估指标、变异范围（常见变异类型）和样本类型要求、质控与室间质评以及记录文档要求等方面均提供了重要的参考价值，医疗机构实验室可参考本共识中提供的专家建议开展中、小Panel的性能确认。
本项目不包含医疗机构CGP NGS开展的管理体系建立、如何选择或建立CGP NGS Panel、临床应用有效性和特定标志物阈值的建立。
一、性能确认的场景、评估指标与变异范围
（一）性能确认的场景
在实验室初步确定初始检测条件并建立分析流程后，需要对CGP NGS检测项目进行性能确认，性能确认方案应在积累性能确认数据之前完成，开发、优化和熟悉过程中收集的数据不可作为性能确认数据的一部分。但这些数据可用于评估测试性能，从而设定可接受的性能标准，并确定样本的数量和类型。
性能确认方案应从明确的预期用途开始，决定所需的样本类型和性能指标特征。在性能确认开始前，性能确认方案需得到实验室负责人的批准。针对实验室自研或未获得NMPA批准的商品化体外诊断试剂盒，在正式开展检测前完成确认流程，明确质控标准，建立SOP，并在仪器或关键试剂更换、检测样品类型变化时，应重新进行性能确认。对已获得NMPA批准，但实验室进行了修改的NGS检测产品，在开展常规检测前，也应进行性能确认。
共识意见 1
未经NMPA批准的商品化CGP NGS检测、实验室自行研发的CGP NGS检测，在开展常规检测前应进行性能确认。
（二）性能确认覆盖的变异范围和指标
CGP NGS Panel通常可检测包括SNV、Indel、CNV、基因重排在内的多种基因变异类型。因此，在设计CGP NGS Panel时，需充分了解该NGS Panel的预期临床用途，基于预期临床用途对CGP NGS Panel进行性能确认。性能确认覆盖的基因变异类型与范围应包括遗传特征明确且将用于临床检测的样本［如石蜡包埋（formalin-fixed and parrffin-embedded， FFPE）样本、血液、胸水、脑脊液、骨髓等］，应覆盖常见变异类型（SNV、Indel、CNV、基因重排）中的代表性变异位点。
根据美国临床实验室改进修正案的监管要求，未经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration， FDA）批准的实验室自建检测必须考虑准确性、精密度（重复性和重现性）、报告范围、参考范围（正常范围）、分析敏感性（检测限或定量限）、分析特异性（干扰物质）和任何其他相关参数（如残留物）。尽管各种指导文件定义了上述分析性能特征，但准确性的定义尚需细化，以便更好地满足NGS体细胞变异分析的需要。因此，建议用阳性符合率（percent positive agreement， PPA）和阳性预测值（positive predictive value， PPV）表示准确性。CGP NGS Panel的性能确认应包含整体的性能确认方案，包括样本类型和数量、PPA和PPV、基因变异检测的重现性和重复性、检测限、干扰物质、生物信息分析流程的性能确认和其他参数等。性能确认主要指标的定义与公式如下：
1. 准确性：是指测定结果和真实结果的一致性程度。NGS检测的准确性定义是指测定检出的序列与参考序列的一致性程度。建议用PPA和PPV表示。
2. 精密度：是指同一样本在多次实验中结果的一致程度，包括重复性和重现性。重复性是指在同一条件下（相同环境、相同操作人员、相同检测流程、相同仪器）多次测量同一序列，测定结果的一致程度。重现性是指由不同操作人员、不同仪器（相同型号）进行同一序列测量结果的一致性程度。精密度的计算方式为事件/样本数量的平均值和方差，并通过样本量和上机数量进行聚合。
3. 分析敏感性：是指对阳性样本检测结果为阳性的比例。NGS检测的敏感性定义是指对变异位点的检测结果为阳性的比例。
4. 分析特异性：是指一种检测方法仅对样本中的待测物质反应，而与其他物质不发生反应的能力。NGS检测的特异性定义是指对没有变异位点检测结果为阴性的比例。
5. 检测限：是指可重复检测（95%）待测物质的最低浓度水平。NGS的检测限定义是指95%的样本能够正确检出变异位点的最低等位基因百分比。
PPA是检测到的已知变异比例，所有真实变异必须为已知变异。可使用参考样本或参考方法来确定基因变异的真实情况。当使用参考方法时，可能会使用组合的参考方法。由于性能确认的性能可能因变异类型不同而产生差异，因此应确定每种变异类型的PPA（如SNV、Indel、CNV、基因重排等结构变异）。
在分析性能确认数据时，应确定并记录每个样本的已知阳性检出率（即平均值、标准差、置信区间、容忍区间或可靠性），应要求所有真实变异必须为已知变异，且可使用参考样本或参考方法确定变异的真实情况。
与PPA类似，应针对每种变异类型（如SNV、Indel、CNV、基因重排等结构变异）确定其PPV。记录每种变异类型的PPA和PPV。
由于仪器、试剂和技术的差异，检测过程会在每一步引入随机误差（或不准确性）。为了最大限度地减少差异，仪器、试剂和人员均必须符合预期目的，通过性能确认进行量化。
应进行重复性（批内）和重现性（批间）测试，建议在所有NGS检测步骤和全部检测时间内，至少需要评估3个样本，每个样本的检测流程需要包含所有仪器、多名测试人员和多批次试剂。因此，在获取性能确认数据之前，需要设置测试合格的标准，在每个NGS测试步骤中对差异进行量化。
每种基因变异的检测限建议在优化与熟悉检测流程阶段使用细胞系混合实验进行估计，检测下限（lower limit of detection， LLOD）定义为95%的样本被可靠地检测到的等位基因频率。不同类型变异可能有不同的LLOD，应针对每种变异类型确定LLOD。需设置敏感性对照，以确保在LLOD情况下检测到目标变异。
在性能确认和临床测试期间，可使用质粒对照和其他人工构建的载体，证明某些变异检测的准确性。
在性能确认过程中应去除可能影响检测结果的干扰物质（如重金属固定剂、黑色素、血红蛋白和胆红素、人总蛋白、酒精、蛋白酶K、福尔马林、石蜡、DNA分子标签等）。核酸提取和纯化步骤通常会去除潜在的污染物，但必须具体考虑到性能确认过程中的样本类型，以确保所有的预期类型样本都可用于后续扩增和NGS测序。
此外，应考虑DNA重复序列和假基因的干扰。对于高度片段化的DNA，测序读段如果来自假基因，则可能会发生错误比对，产生假阳性结果。高度重复的序列可能会消耗捕获探针，从而减少了目标区域的测序序列覆盖率。对于检测低频变异的NGS实验，交叉污染是一个公认问题。应通过测试设计和性能确认，以及无模板对照（no template control， NTC）样本来解决交叉污染问题。此外，在性能确认期间及后续的临床测试过程中，每次测试都应包含NTC样本，用于确认扩增步骤中是否存在来自邻近样本的污染。
共识意见 2
肿瘤CGP NGS的性能确认，应该针对CGP覆盖的常见变异类型选择代表性变异位点，应关注准确性、精密度、分析敏感性、分析特异性和检测限等指标。
二、复杂生物标志物的性能确认
CGP NGS Panel的性能确认中，除需包含SNV、Indel、CNV和基因重排等变异类型外，还需覆盖常见的复杂生物标志物（如TMB、MSI、HRD等）。
对于MSI、TMB、HRD等复杂预测性生物标志物，越来越多的患者治疗决策受以上指标的影响，复杂生物标志物的检测提供了更多潜在治疗获益机会。因此，定义预分析、样品处理和性能确认的高质量性能确认指标的标准尤其重要。此外，对于复杂的生物标志物，如TMB、MSI、HRD等，必须全面地评估测试大范围基因组区域，并在多种肿瘤类型中得到良好的性能确认。复杂生物标志物作为CGP NGS的重要检测指标，其性能确认具有必要性。
以TMB为例，作为CGP NGS检测的特征，TMB是指通过计算特定基因组区域内每兆碱基对的体细胞非同义突变的个数，评估肿瘤的突变负荷状态，间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效。全外显子组测序（whole exome sequencing， WES）是进行TMB检测的“金标准”，WES检测分析的TMB值与免疫治疗临床疗效相关。TMB的性能确认，建议与WES 评估的TMB 值进行一致性评价，在检出基因突变频率≥5%的体细胞突变基础上，保证TMB值的准确性和稳定性。TMB值在不同癌种中存在显著差异，应依据免疫检查点抑制剂药物的临床疗效确定TMB阈值。在我国医疗机构开展CGP NGS Panel的TMB性能确认实验，考虑到每次进行Panel特异性TMB（Panel specific TMB， psTMB）与WES TMB的一致性比对评价的实际操作、成本等因素，可采用psTMB的重复性与重现性分析的策略，对TMB进行性能确认。
CGP NGS检测性能确认在测序平台水平的重复性和重现性表现为基因变异与复杂生物标志物的高度符合率，以及样品水平的高重现性。可针对CGP NGS的复杂生物标志物开展对应的重复性和重现性的性能确认。
共识意见 3
肿瘤CGP NGS的性能确认中，可以针对覆盖的常见复杂生物标志物（如TMB、MSI、HRD等）开展性能确认。
三、性能确认覆盖的样本类型、数量、临床性能与药效判定
（一）性能确认的样本类型选择
CGP NGS Panel进行性能确认时，应使用检测方案要求的样本类型，以便性能参数能适用更大患者群体的检测。CGP NGS Panel不能像单一分析物测试一样进行性能确认，其样本类型、变异类型、基因变异频率、外显子区或目标区域存在较大差异。因此，必须使用基于误差的方法进行性能确认，其解决的问题包括样本类型、变异类型、基因组区域或基因变异频率，其测试性能可以外推至其他样本类型、变异类型、基因组区域和基因变异频率。
基于误差的方法参考美国临床与实验室标准研究院发布的基于风险管理的实验室质量控制实践指南，其中特别强调：实验室应系统地识别潜在的失效模式，并评估发生的故障对患者造成伤害的可能性，即在整个过程的每一步确定伤害的可能性、可检测性和严重程度。每个误差来源都可以在3个不同的层次上体现并被处理，即检测分析的设计、方法学性能确认和/或质量控制。对于NGS检测的复杂流程，基于误差的设计和优化方法非常重要。对潜在故障点的概率充分了解，有助于确定流程中特定步骤所需的验证和质量控制级别，且有助于对可能出现的错误进行故障排除，对测试系统组成部分的修改进行验证。
应选择一系列遗传特征明确的样本，最大程度地体现以上因素引起的变化。性能确认测试的每种样本类型的数量应与临床测试的预期样本类型成比例。如果已知样本类型存在问题（如FFPE组织样本），建议使用额外的性能确认样本来确定样本质量或数量对测试结果的影响。
大多数CGP NGS Panel检测不能覆盖所有基因变异的样本，因此，应纳入与检测预期用途相关的热点变异样本（如结肠癌NGS Panel应纳入KRAS exon12、13与61的变异），也可以纳入计算机模拟的数据集，但不能取代真实样本的数据。因此，可采用真实样本和计算机模拟样本组合的形式，评估性能确认分析中的样本变异类型。
因此，应包括至少2个特征明确的样本，在所有目标区域都有确定的检测序列。商品化的参考样本可用于此目的，通常有以下3类。
1. 参考细胞系：HapMap 细胞系［如NA12878、NA19240、NA18507、NA19129（coriell institute for medical research， Camden， NJ）］，可单独使用或混合使用来模拟不同的基因变异频率、LLOD等。
2. 合成DNA片段：在已知的位置掺入特定的序列变异，也可按照已知的等位基因比例混合，评估平台性能、文库制备和生物信息学流程等。
3. 遗传特征明确的细胞系：参考品样本可用于检测错误来源。当性能确认数据不足以确保潜在的错误存在时，应使用它们来监控检测步骤。可以为过程中的每个步骤设计对照，也可以使用单个对照样本监控多个步骤节点。
性能确认样本应包括特征明确的临床样本类型（石蜡包埋FFPE样本、血液、胸水、脑脊液、骨髓等）。样本需包含检测的各种变异类型（如SNV、Indel、CNV和基因重排等），包含与CGP NGS Panel预期临床用途相关变异的样本、2个或2个以上与CGP NGS Panel覆盖区域一致的参考样本。
共识意见 4
对于样本类型的选择，性能确认的样本应包含所有变异类型和复杂生物标志物。样本类型可包括携带已知变异的标准品和与预期用途中样本类型一致的临床样本。
（二）性能确认的样本数量选择
CGP NGS Panel的性能确认过程中，样本数量是一个关键问题。为了估计潜在群体的分布和单个样本的表现，应使用容忍区间进行评估，对于正态分布的群体，可以确定容忍区间的下限，相关统计学原理请参考相关文献。
样本数量的评估和选择需确定最少读段覆盖深度的置信区间和容忍区间。通过95%置信度下确认的置信区间下限来推断整个群体平均值的下限。置信区间可用于预测群体的表现，容忍区间可用于预测某个样本的表现，但容忍区间的估计仅适用于正态分布的群体，而潜在群体的分布通常不是正态的（例如数据不能超过自然边界0或100%时）。
无论潜在群体如何分布，可使用非参数方法定义容忍区间，估计性能参数。单侧非参数容忍区间可通过满足累积二项式方程的K值，确定可靠性和置信区间所需的样本数量。例如，具有95%置信度和95%可靠性的单侧容忍区间，不管是参数指标还是非参数指标，可由一组59个或更多样本来确定性能。
因此建议，无论选择参数检验还是非参数检验来评估容忍区间，性能确认期间最少测试59个样本。实验室收集59个包含SNV的样本质量指标数据（如读段测序深度、读段长度、偏倚和质量评分）。理论上，59个样本还应包含其他变异，如Indel等。若某种变异类型（如大片段缺失、结构变异、CNV等）的样本较少，短时间内无法获得足够的样本进行性能确认，则应按NGS 不能准确检出该位点对待，需使用其他方法（如PCR法、Sanger测序法或杂交芯片法等）对这类型位点的阳性结果进行确认，或在NGS的检测报告中注明检测的局限性。
整个性能确认过程需进行6轮NGS检测，A和B分别代表执行性能确认测试的2名技术人员。采用单盲实验，即测试技术人员不知道样本和标准品的信息。每一轮性能确认组合由12个不同的标准品或样本组成（具体组合参见NGS检测的性能确认样本矩阵表），每轮次的技术员需独立操作。该性能确认矩阵包含了所有检测的技术性能，可有效地评估各项性能参数。NGS检测的性能确认样本矩阵表见表1。
共识意见 5
样本数量的选择，针对每种变异类型，应在95％置信度（α=0.05）和95％可靠性（r=0.95）的基础上，使用容忍区间来评估性能确认的最少样本数。
（三）临床性能确认
疾病内在的生物学复杂性对NGS Panel检测的临床敏感性和特异性影响最大。CGP NGS Panel的预期用途如肿瘤诊断、预测或治疗决策需要提前定义清楚。有些NGS检测仅对有限的目标基因区域进行分析（如热点分析），如果其预期用途仅限于特定的基因变异（如结肠直肠癌中KRAS/NRAS基因变异，用于指导西妥昔单抗的靶向治疗），则可能足够满足临床需求；但如果预期用途是肿瘤诊断和预后分析，其临床敏感性可能不及更全面的CGP NGS检测。因为其无法检测到热点区域以外的变异，对有限变异类型（如仅SNV和小片段Indel）的检测，其临床敏感性可能不及同时检测大片段Indel、CNV和基因重排等变异（具有更高的临床特异性）。
实验设计中需确定分析测试的临床有效性（即临床敏感性和特异性）和临床效用，并在性能确认过程中进行评估。因此，性能确认方案必须包括NGS CGP Panel的组成、预期用途、潜在的临床有效性与临床效用以及参考样本。
此外，如果CGP NGS Panel的临床预期用途是基于基因变异的组合，建立肿瘤的诊断流程，或是具有预测分析算法的多重NGS测试，则需要在患者队列进行全面的临床性能确认，性能确认须确保诊断的准确性。对于此类NGS Panel测试，应遵循与分析性能确认相同的指南和计算方法。
共识意见 6
临床性能确认应结合CGP NGS的预期用途，使用对应癌种和样本类型中变异信息已知的回顾性临床样本，开展临床敏感性和临床特异性检测。
（四）性能确认的药物有效性判定
在以往的CGP NGS Panel临床性能确认过程中，与药物或临床试验相关的专家建议被临床医师作为临床评估和解读的重要参考。在全面的临床性能评估中，需结合患者的其他临床信息以及补充检测或影像学检测结果综合评估。
参考美国FDA已批准的泛癌种“Foundation Medicine CDx Panel”的临床性能确认，基于伴随诊断临床试验检测分析确定的临床有效性，与FDA已批准该适应证的正交比较分析检测的非劣效一致性结果，可通过回顾性或前瞻性分析、或临床桥接试验研究结果等进行临床性能确认。
考虑到临床实践过程中，药物有效性临床研究的目的在于评价申报产品的伴随诊断预期用途，如与新研发的抗肿瘤药物同步研发的伴随诊断试剂，则可提供与药物同步研发的药物临床试验资料作为其伴随诊断证据。根据伴随诊断相关指导原则，目前尚不能为药物有效性的一致性比较提供诊断证据的产品，可选择桥接试验或药物疗效观察性研究数据进行伴随诊断的验证。因此，基于当前在医疗机构实施CGP NGS Panel临床性能确认的可行性，无需包含特定生物标志物的药物有效性以及药物阈值判定。在未来通过CGP NGS Panel开展的药物临床试验与伴随诊断研究中，可考虑开展前瞻性样本收集与临床性能确认。
共识意见 7
考虑到可执行性，CGP NGS的临床性能确认需要进行药物有效性和阈值判定时，相关数据可随临床检测的开展进行前瞻性收集。
四、检测流程更改后的补充性能确认
CGP NGS Panel的性能确认完成后，实验室如修改或改进测试当中的1个或多个组成部分（如添加额外的基因位点，使用新版本的试剂或分析流程，或使用新型号的测序仪），必须考虑可能引入的误差。对于潜在错误可能性很小的变化，可以通过质量控制检测出来。另外，有些变化（如测序平台）可能需要执行完整的性能确认。
实验室负责人有责任确定方案中任何变更的潜在错误，并提供书面证据，证明潜在错误不太可能发生或容易被检测到。无论改变的大小，建议补充性能确认应包括端到端测试已知变异的样本，检测可能发生的意外错误。当新的基因或基因组区域被添加到现有检测区域时，实验室应补充性能确认，分析大量样本并确定新增的基因区域没有改变CGP NGS Panel的分析性能，并且新添加基因区域或位点的性能特征符合预期用途。
对于经过性能确认的CGP NGS Panel检测，任何增加或更改都应补充性能确认，包括性能确认方案和结果的总结，应在补充性能确认期间，评估可能导致的潜在误差来源。
共识意见 8
已开展过性能确认的CGP NGS检测，当发生任何组成部分的更改都应进行补充确认。补充性能确认应以端到端的完整方式测试多个已知变异样本，确保更改不影响CGP NGS的临床预期用途。
五、性能确认的场地、人员、质控、室间质评与文档管理
（一）性能确认的场地、人员要求与质量控制
杂交捕获法NGS建议分区包括样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、打断区（如适用）、电泳区（如适用）、文库制备区、杂交捕获区、扩增区和测序区。但是，根据不同的平台和检测流程，分区设置可有所不同，应根据实际情况确定实验室分区设置。
实验室人员应为具备国家要求的相应资质的专业人员，“湿实验”团队应具有《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》，并包括病理医师人员。“干实验”团队要包括熟练掌握高通量测序数据分析的人员，也要包括熟悉肿瘤分子生物学基础，了解治疗药物和肿瘤变异研究最新进展的报告解读、签发人员。
针对NGS临床检测实验室中使用RNA作为起始样本，RNA的提取与建库需要严格的分区，并保证无菌无RNase污染，防止RNA的降解。实验操作过程中RNA处理每个一步骤所用的试剂名称、生产厂家、批号，以及每一步操作后的质量指标（如RNA的完整性数值等）都需明确记录。
共识意见 9
CGP NGS在医疗机构开展，实验室人员应为具备国家要求的相应的资质的专业人员，高通量测序实验室场地应注意进行合理分区，防止核酸污染和保障生物安全。
（二）实验室质量控制与室间质量评价
在临床诊断环境中实施NGS检测对实验室基础设施建设要求较高。测试和系统的性能确认、质量控制、质量保证和质量管理技术更具挑战性，其复杂程度因检测平台和检测广泛性而不同。需针对特定的检测建立质量控制措施，且必须应用于每次实验，相关内容如下。
NGS的样本要求因疾病背景、个体采集、组织处理、处理方案和检测方法而异。在NGS分析性能确认期间，实验室必须对所有可能的样本类型（如FFPE样本、血液、胸水、脑脊液、骨髓等）进行性能确认，并建立样本接受标准。未经性能确认的样本应被视作不适合进行CGP NGS Panel检测。
DNA质量是NGS检测的关键部分，它不仅影响检测的敏感性，还影响到检出变异的数量和准确性。实验室必须建立准确的质量控制方法，明确定义分析前的样本质量，根据分析的敏感性准确评估所需的DNA最小量，且建立调整DNA起始量的方法。
RNA质量对于肿瘤的基因融合检测至关重要，使用RNA作为起始材料检测基因融合，需要使用精确的核酸定量与定性质控方法。RNA的质控指标应包括完整性、浓度、核糖体片段的比例，以及是否存在降解物等。可通过使用Agilent 2100生物分析仪检测RNA完整值、荧光定量方法检测RNA浓度以及通过自动化电泳仪检测RNA的DV200指标对RNA质量进行评估。
准确的文库定性和定量是获得可靠数据的关键。上样量不足或片段大小不合适的文库会导致覆盖率和读段深度降低。相反，过量会导致流动槽或磁珠饱和，产生测序数据问题。必须对文库进行定性检测，实验室必须确立标准化方案，使片段大小在预期的分子量范围内，同时尽量减少引物二聚体、接头二聚体和高分子量条带。同时，建议进行文库定量，实验室应根据自身需求决定文库定量的检测方法。
此外，每次测序应包括敏感性对照，以确保能在LLOD检测到目标变异。当缺少性能确认数据或剩余误差风险仍过高时，还需要额外的参考样本。对于靶向NGS检测，应在文库制备中加入NTC样本，以确保性能确认试剂没有被污染。必要时应包括敏感性对照，以确保在检测限下限检测到目标变异。
能力验证决定了各个实验室进行特定检测或测试的性能，并监控实验室的持续检测性能。此外，能力验证的一个重要部分是实验室间的横向比较。CGP NGS Panel检测的室间质量评估包含该测试检测到代表性序列变异类型（如SNV或Indel）的能力。为扩展CGP NGS Panel检测能力验证的方法，目前已有基于计算机分析用于体细胞变异的能力验证方法。
共识意见 10
CGP NGS检测在医疗机构实施必须针对特定检测建立质量控制措施，在实施前明确SOP并建立实验和测序质量标准，质量标准一旦建立，不得随意改变。同时，鼓励实验室定期参与适当的能力确认计划，如室间质量评估。
（三）生物信息学流程的性能确认
鉴于CGP NGS检测的基因数量多、变异类型多且范围大，遵循分析物特异的性能确认方法是不切实际的。需开发基于方法学的范例，以分析方法学而非测试的特定分析物为中心，通过基于方法学范例进行生物信息学分析流程的性能确认。
遗传特征明确的细胞系可作为参考品样本用于性能确认，尤其是敏感性和检测限分析。对DNA寡核苷酸或质粒进行基因工程改造，包含已知比例，已知位置和已知基因变异频率的特定变异序列来评估生物信息学流程的分析性能。可以利用计算机算法处理遗传特征明确样本的测序文件，将变异引入参考序列文件，生成的模拟文件从序列比对、变异检测、注释、变异解读等步骤进行生物信息流程的分析性能确认；也可以在任何需要的变异位点上对主要变异类型进行人为设计，针对变异位点开发数据模拟算法，产生模拟临床样本复杂度的基因变异混合序列等用于性能评估。
生物信息学流程的性能确认应包括分析中使用的所有组成部分，每个部分必须由具有相应资质的医学分子生物学专业人员和实验室负责人审查和批准。生物信息学流程的性能确认包括但不限于数据预处理、数据比对及质控、变异识别和变异注释等步骤。根据测序类型和检测报告的变异类型选择生物信息学分析流程，并考虑变异识别和评估流程过程中的限制因素以及第三方生物信息学软件对整个流程的影响。对于生信流程中的每一步建立合适的质量指标，并根据实验室认可的规定进行记录。
1. 数据预处理：充分说明生物信息学流程中使用的软件类型及数据预处理步骤。数据文件（如FASTQ格式文件）应包含质控参数，如每个位点碱基质量值的控制参数以及序列长度分布等。明确测序碱基质量值（如质量值Q值得分）的阈值。明确判定实验有效的符合碱基质量值的最低百分比。
2. 数据比对及质控：提供BAM或其他对比文件类型，每个样本的比对结果计算相应的质控参数（如外显子覆盖度、插入片段长度和样本污染情况等）以及判定实验有效的最低接受标准。提供参考序列的选择依据，如为特殊序列，应提供采用该序列的依据。
3. 突变分析：根据CGP NGS Panel检测的基因和变异类型，确认软件工具类型及选择依据。不同变异类型需要选择不同的算法，并提供相应的质控标准以及判定实验有效的最低接受标准。
4. 突变注释：提供每个突变预测的功能性作用以及临床注释解读的形成过程及数据来源依据。
共识意见 11
CGP NGS检测的生物信息学流程性能确认需开发以分析方法学为中心的分析流程。在生物信息学流程性能确认的过程中需要评估数据预处理、数据比对及质控、变异识别和变异注释等步骤的主要标准和参数。
（四）性能确认的记录文档
实验室自研CGP NGS检测的性能确认记录文档具有重要的作用，完整的性能确认记录文档（包括性能确认的原始数据）为实验室人员提供了关键参考，是实验室性能确认的关键证明材料。性能确认记录文档的摘录通常也作为SOP文件的核心信息，实验人员需应严格遵循SOP。性能确认记录文档应包含整个检测流程的SOP文件，包括样本采集与处理、文库制备、测序、数据分析、性能确认结果报告等。
实验室应确定性能确认方案和标准，并详细记录性能确认检测实验的过程。对于基于CGP NGS检测的性能确认中每个组成部分，应该确定规范并记录每个检测组成对于关键因素（如覆盖度、碱基质量等）的局限性。确定并记录基因组的检测区域，包括基因和变异类型，如果关键的测序区域不符合最低性能要求（如最小覆盖标准等），则应修改检测并重新验证以达到最低性能要求。
生物信息学流程的记录文档应包括变异识别、过滤和注释的所有过程。明确所有使用的软件，包括来源（例如内部开发或第三方）以及主要修改内容。建议以列表形式描述所有需要的软件和/或数据库名称、版本及其功能。生物信息学流程的性能确认必须有完整的记录，建立完善的生物信息学分析软件的版本质量控制方案，在性能确认的过程中建立生物信息学分析的SOP及质量控制方案，保证测序数据的分析、解读及报告的准确性与严谨性。生物信息学流程应描述清晰，包括每一步骤使用软件的名称、版本、性能确认的技术参数设置要求。
在CGP NGS检测的性能确认的过程中，应记录所有性能确认检测的失败情况并分析原因，例如，由于未能满足其中1个或多个检测运行质量指标，不符合质量标准的检测区域，不应报告的变异结果等。性能确认记录文档应包括以下主要内容。
1. 性能确认的目的和术语：（1）性能确认的场景：实验室场地、人员、资质、时间等；（2）临床预期用途描述；（3）关键术语定义。
2. 性能确认的研究范围：（1）样本类型；（2）涵盖的变异类型与原因；（3）样本的具体信息。
3. 性能确认的完整研究方案。
4. 性能确认的结果：（1）实际观测的质控结果；（2）实际观测的性能确认结果。
5. 性能确认结果总结。
6. 本次性能确认的设计局限性说明。
7. 附录（如需要）。
共识意见 12
CGP NGS检测的性能确认记录文档，应包含整个检测流程的标准操作规程文件，包括样本采集与处理、文库制备、测序、数据分析、性能确认结果报告等过程描述。实验人员需应严格遵循标准操作规程。
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