瘤胃唾液酸代谢障碍通过促进菌群紊乱加剧奶牛乳腺炎发生
Sialic acid exacerbates gut dysbiosis-associated mastitis through the microbiota-gut-mammary axis by fueling gut microbiota disruption
Article，2023-4-17，Microbiome，[IF 16.837]
DOI：10.1186/s40168-023-01528-8
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37069691/
第一作者：Caijun Zhao (赵才军)
通讯作者：Yunhe Fu (付云贺); Naisheng Zhang（张乃生）; Xiaoyu Hu（胡晓宇）
合作作者：Min Qiu（邱敏）；Lijuan Bao（包丽娟）；Keyi Wu（吴可祎）；Xiangyue Meng（孟祥玥）；Yihong Zhao（赵艺鸿）；Lianjun Feng（冯炼君）；Shiyu Duan（段石玉）, Yuhong He（和玉红）
主要单位：
吉林大学动物医学学院 (Department of Clinical Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, Jilin Province, China)
四川大学华西医院 (Department of Breast Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, 610041, Sichuan Province, China)
- 摘要 -
背景
乳腺炎是影响人和动物，尤其是泌乳奶牛，最严重的疾病之一。奶牛乳腺炎的发生被报道与高精饲料诱导的亚急性瘤胃酸中毒（SARA）有关，但潜在机制尚不清楚。
结果
在本研究中，我们发现SARA相关乳腺炎奶牛发生显著的瘤胃代谢紊乱，尤其是游离唾液酸水平升高。给抗生素诱导菌群紊乱小鼠，而非正常小鼠，补充唾液酸（Neu5Ac）可诱导小鼠发生乳腺炎症，乳腺炎性通路TLR4-NF-κB/NLRP3激活增加，伴随系统性炎症增加和肠道、乳腺屏障功能破坏。唾液酸补充加剧抗生素引起的肠道菌群紊乱，尤其增加肠杆菌科细菌丰度，并与炎症指标相关。移植唾液酸补充的肠道菌群紊乱小鼠的肠道微生物，可诱导受体小鼠乳腺炎症。体外实验证实，致病性大肠杆菌可优先利用唾液酸作为碳源，促进其生长和毒力增强，并增加其促炎能力。使用钨酸钠清除肠杆菌科或补充共生罗伊氏乳杆菌，可缓解唾液酸加剧的乳腺炎症。SARA奶牛中，瘤胃细菌唾液酸酶表达增加，伴随具有唾液酸利用能力的机会致病菌Moraxellaceae等丰度增加。移植SARA伴发乳腺炎奶牛的瘤胃菌群可导致小鼠肠道菌群紊乱和唾液酸代谢失调，并诱导小鼠乳腺炎症，而使用唾液酸酶抑制剂扎那米韦可逆转该现象。
结论
我们的研究结果表明，瘤胃唾液酸代谢障碍通过促进菌群紊乱加剧乳腺炎症，表明微生物-肠道/瘤胃-乳腺轴在乳腺炎发病过程中的作用，并提示调控肠道菌群及其代谢或是防治肠道菌群紊乱相关乳腺炎的潜在途径。
- 引言 -
肠道中复杂的有机群落被称为肠道菌群，已被证明是影响生理稳态和疾病结局的最重要的调节因子之一。大量研究表明，肠道菌群通过营养吸收、屏障维持、免疫和代谢维持调节宿主健康，而肠道菌群脆弱平衡的破坏-肠道菌群紊乱，在许多疾病的发生、发展和结局中起着核心作用，包括炎症性肠病、脂肪肝、肥胖、癌症和感染。通常，肠道菌群引起的代谢改变是介导宿主-微生物群相互作用和影响疾病进展的最直接方式。例如，肠道微生物源性短链脂肪酸(SCFAs)有助于维持肠道厌氧条件，调节粘膜和全身Treg/T17平衡，并参与脑先天免疫系统代谢。膳食色氨酸中芳烃受体(AhR)的微生物分解代谢配体通过I型干扰素和小胶质-星形胶质相互作用调节星形胶质细胞活性，从而减轻中枢神经系统炎症。另一方面，肠道生态失调衍生的代谢物增加了患病的风险。微生物代谢物4-乙基苯基硫酸酯(4-EPS)可以通过损害少突胶质细胞成熟和减少少突胶质细胞与神经元的相互作用来改变大脑活动和焦虑行为。Koh等人发现，肠道菌群代谢组氨酸衍生的咪唑丙酸盐损害葡萄糖耐量和胰岛素信号传导。此外，肠道菌群产生的三甲基-5-氨基戊酸(TMAVA)通过减少脂肪酸氧化促进心脏肥厚。这些结果表明，探索宿主或微生物群介导的代谢改变对于深入了解肠道微生物群相关远端疾病的发病机制非常重要。
乳腺炎是人类和动物常见的疾病之一，可增加患乳腺癌的风险，并影响乳汁的产量和质量，阻碍乳制品行业的发展。越来越多的证据表明，在乳腺炎的背景下，可能存在“微生物-肠道-乳腺轴”。研究发现，乳腺炎奶牛的粪便微生物群移植(FMT)可诱导小鼠乳腺炎。我们之前的研究也表明，抗生素处理的小鼠对金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)诱导的乳腺炎的易感性增加，证实了微生物-肠道-乳腺轴在乳腺炎发病中的重要作用。先前的一项研究表明，肠道微生物群对不同饮食模式的改变诱导了不同的乳腺代谢谱。而受损的有益代谢物水平，包括SCFAs和微生物代谢AhR配体，可以调节病原诱导小鼠乳腺炎的易感性。然而，尚不清楚肠道菌群相关代谢物在乳腺炎发病机制中的作用。
由于奶牛在产奶期的高营养需求和奶牛场对产奶量和品质的追求，奶牛饲料中高精料(HGD)比例增加。然而，过量食用HGD和低膳食纤维会降低瘤胃pH值，破坏瘤胃菌群的组成和功能，导致奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒(SARA)。研究发现，SARA奶牛对病原体引起的乳腺炎的易感性增加。并且长期食用HGD会增加全身炎症反应和乳腺炎，这与SARA奶牛中富含革兰氏阴性菌产生的瘤胃脂多糖(LPS)水平升高有关。然而，菌群紊乱引起的代谢变化是否促进瘤胃条件致病菌的扩张和LPS的释放，并调节乳腺炎的发展，目前尚不清楚。
在本研究中，我们采用非靶向代谢组学和16S rRNA测序技术研究了SARA奶牛的瘤胃代谢和菌群特征。基于代谢组学结果和相关性分析，我们利用抗生素治疗小鼠模型，重点研究唾液酸(SAs、Neu5Gc和Neu5Ac)在乳腺炎发病中的作用及其机制。结果表明，SA通过微生物-乳腺轴加速菌群紊乱，从而加剧了肠道生态失调诱导的乳腺炎。本研究不仅为乳腺炎的发病机制提供深入理解，并为寻找乳腺炎的潜在干预策略提供了基础。
- 结果 -
SARA相关乳腺炎模型建立和实验设计
Establishment of a cow SARA‑associated mastitis model and experimental design
通过给健康奶牛饲喂标准饲料和高精饲料（70%谷物）8周，建立高精料诱导SARA伴发奶牛乳腺炎模型，随后收集瘤胃液进行非靶向代谢组学测定 (图1A-C)。对奶牛瘤胃代谢物进行鉴定后筛选后，选择目标代谢物验证生物学功能，随后进行瘤胃菌群移植，并靶向抑制目标代谢物合成，探究其对乳腺炎发生的影响(图1 D-F)。
图1 实验流程。
SARA奶牛瘤胃游离唾液酸水平升高
SARA cows have altered metabolite levels in the rumen
瘤胃代谢组学检测发现，与健康奶牛相比，SARA奶牛瘤胃代谢紊乱，其中唾液酸水平（Neu5Ac和Neu5Gc）水平显著增加(图2A-E)。
图2 健康和SARA奶牛瘤胃代谢特征。
唾液酸补充加剧肠道菌群紊乱诱导的小鼠乳腺炎
Consumption of SA exacerbates gut dysbiosis‑induced mastitis in mice
通过给健康小鼠和抗生素紊乱菌群小鼠补充Neu5Ac 3周(图3A)，发现唾液酸补充的肠道菌群紊乱小鼠，而非正常小鼠，发生明显乳腺组织损伤，促炎细胞因子TNF-α和IL-1β，以及MPO活力增加(图3B-F)，并降低乳腺紧密连接蛋白ZO-1，Occludin和Claudin-3表达(图3G-J)。
图3 唾液酸补充加剧肠道菌群紊乱诱导的小鼠乳腺炎。
唾液酸补充加剧抗生素诱导的肠道菌群紊乱
SA facilitates antibiotic‑induced gut dysbiosis
与对照小鼠相比，抗生素处理增加小鼠肠道变形菌门细菌丰度，而唾液酸补充后，加剧抗生素诱导的肠道菌群紊乱，并且富集的差异菌属与乳腺炎症指标丰度呈正相关 (图4)。
图4 唾液酸补充加剧抗生素诱导的肠道菌群紊乱
唾液酸加剧乳腺炎症依赖于肠道菌群
FMT from the A or AN group mimics mastitis in recipient Mice
通过将不同处理小鼠肠道菌群移植给受体小鼠，发现唾液酸补充的肠道菌群紊乱小鼠的肠道菌群可诱导受体小鼠发生明显乳腺组织损伤，增加促炎细胞因子TNF-α和IL-1β，以及MPO活力水平(图5)。
图5 唾液酸加剧乳腺炎症依赖于肠道菌群
唾液酸促进肠道机会致病生长和毒力增强
SA boosts pathogenic bacterial growth and virulence gene expression, aggravating pathogen‑induced proinfammatory cytokine production and mastitis
体外研究发现，唾液酸可促进致病性大肠杆菌生长，并增加其毒力基因表达和促炎能力，而使用钨酸钠靶向清除肠道中肠杆菌科细菌丰度，可缓解唾液酸加剧的乳腺炎症(图6)。
图6 唾液酸促进肠道机会致病生长和毒力增强。
SARA奶牛瘤胃唾液酸代谢障碍诱发乳腺炎症
SARA cows have different ruminal microbial compositions and sialidase inhibitor alleviates mastitis in mice caused by RMT for SARA cows (SRMT)
对SARA和健康奶牛进行细菌唾液酸酶测定发现，SARA奶牛瘤胃细菌唾液酸酶浓度增加，伴随具有唾液酸利用能力的共生菌丰度降低，而能够代谢唾液酸的机会致病菌丰度增加，如Moraxellaceae。将SARA奶牛瘤胃菌群移植给小鼠后，可诱导小鼠肠道菌群紊乱和唾液酸水平增加，导致小鼠乳腺炎症，而使用唾液酸酶抑制剂Zanamivir可逆转该现象 (图7)。
图7 SARA奶牛瘤胃唾液酸代谢障碍诱发乳腺炎症。
讨论
我们的研究揭示了SARA奶牛的瘤胃代谢变化，发现唾液酸代谢障碍促进了菌群紊乱诱导的乳腺炎，其潜在机制涉及肠杆菌科的过度扩张和随后的肠道屏障损伤和全身性炎症(图8)。相反，减少肠杆菌科、共生菌治疗和减少游离唾液酸可改善小鼠肠道菌群紊乱相关的乳腺炎。我们的研究结果首次证明，SARA导致的代谢变化促进肠道机会致病菌扩张，通过微生物-肠道-乳腺轴加剧了全身炎症和乳腺炎。我们的研究再次佐证了课题组先前提出的“瘤胃/肠源性乳腺炎”这一理论假设，并为通过调节肠道菌群和代谢预防乳腺炎和其他疾病提供理论指导。
图8 瘤胃唾液酸代谢障碍通过促进菌群紊乱加剧奶牛乳腺炎发生
参考文献
Caijun Zhao, Xiaoyu Hu, Min Qiu, Lijuan Bao, Keyi Wu, Xiangyue Meng, Yihong Zhao, Lianjun Feng, Shiyu Duan, Yuhong He, Naisheng Zhang, Yunhe Fu. Sialic acid exacerbates gut dysbiosis-associated mastitis through the microbiota-gut-mammary axis by fueling gut microbiota disruption. Microbiome 2023 Apr 17;11(1):78. doi: 10.1186/s40168-023-01528-8
- 作者简介 -
第一作者
吉林大学
赵才军
博士
赵才军，吉林大学动物医学学院博士研究生，主要关注肠道菌群与乳腺炎发病机制，肠道菌群与代谢和免疫等。目前以第一作者在Microbiome、Cell Reports、Plos pathogens、NPJ Biofilms and Microbiomes、Microbiology Spectrum等期刊发表论文10篇。
通讯作者
吉林大学
张乃生
教授
张乃生，吉林大学动物医学学院教授，博导。现担任中国畜牧兽医学会动物毒物学分会副理事长，中国畜牧兽医学会家畜内科学分会常务理事，吉林省畜牧兽医学会副理事长，东北地区兽医内科学会副理事长（兼秘书长），国家自然科学基金委员会第十一届生命科学部专家评审组成员。从事动物内科病、兽医临床症状鉴别诊断课程的教学、肠道菌群与疾病的科研及临床工作。目前主要研究方向为奶牛乳腺炎的发病机理及防治、马属动物胃肠病防治、动物营养代谢病与中毒病。承担科研课题 20 余项，获国家科技进步三等奖 1 项、部（省）科技进步二等奖 4 项；先后主（副）编《动物普通病学》、《兽医临床症状鉴别诊断学》等等著作 16 部，发表国内外学术论文 150 余篇， 其中在 Microbiome、The ISME Journal、 Food&Function、 Journal of Agricultural and Food Chemistry 等杂志发 SCI 论文100余篇。
吉林大学
付云贺
教授
付云贺，吉林大学动物医学学院教授，博导。吉林大学唐敖庆领军教授，国家自然科学基金优秀青年基金获得者，国家自然科学基金二审专家。主要研究方向：肠道菌群与奶牛乳腺炎。研究发现肠道菌群紊乱可诱发乳腺炎，提出“肠源性乳腺炎”概念。以第一/通讯作者在ISME journal (2020)，Cell reports (2022)，Microbiome (2022, 2023), Plos pathogens (2021, 2023), Journal of advanced research (2023), NPJ Biofilms and Microbiomes (2023)等杂志发表SCI论文60余篇。主持国家自然科学基金等项目13项。目前担任iMeta青年编委和Microbiology Spectrum等期刊编辑。
吉林大学
胡晓宇
副教授
胡晓宇，吉林大学动物医学学院副教授。一直从事肠道菌群与奶牛乳腺炎关联性及关联机制方面的研究工作。研究成果以第一作者（含并列）和通讯作者（含并列）在ISME Journal、Microbiome、Microbiology Spectrum、Free Radical Biology and Medicine、FEMS Microbiology Ecology、中国兽医学报等国内外杂志发表学术论文20余篇；获得博士后科学基金第2批特别资助（站前）、博士后面上项目和国家自然科学基金青年基金羡慕各1项，参与国家自然科学基金面上项目3项；目前担任iMeta青年编委和Frontiers in Veterinary Science编辑。
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