Science:亚硝酸盐氧化细菌在黑暗海洋中的主要作用

版权声明:本文为“宏基因组”公众号原创,未经博主允许不得转载。 https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/89323180


image

亚硝酸盐氧化细菌在黑暗海洋中的主要作用

Major role of nitrite-oxidizing bacteria in dark ocean carbon fixation

撰文:咖啡树 中国科学院大学

责编:刘永鑫 中国科学院遗传与发育生物学研究所

Science, [41.058]

https://doi.org/10.1126/science.aan8260

Published:24 Nov 2017

第一作者:Maria G. Pachiadaki1

通讯作者:Ramunas Stepanauskas1 rstepanauskas@bigelow.org

合作作者: Eva Sintes2, Kristin Bergauer2, Julia M. Brown1, Nicholas R. Record1, Brandon K. Swan1,3, Mary Elizabeth Mathyer1,4, Steven J. Hallam5,6,7,8, Purificacion Lopez-Garcia9, Yoshihiro Takaki10,11, Takuro Nunoura10, Tanja Woyke12, Gerhard J. Herndl2,13

1 美国,比奇洛海洋科学实验室 (Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, East Boothbay, ME 04544, USA.)

2奥地利,维也纳大学湖沼与生物海洋学系 (Department of Limnology and Bio-Oceanography, University of Vienna, 1090 Vienna, Austria.)

3美国,国家生物防御分析与对策中心 (National Biodefense Analysis and Countermeasures Center, Frederick, MD 21702, USA.)

4美国,华盛顿大学医学院皮肤科,内科,药物基因组学中心,瘙痒研究中心(Division of Dermatology, Department of Internal Medicine, Center for Pharmacogenomics, and Center for the Study of Itch, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110, USA.)

5加拿大,不列颠哥伦比亚大学微生物与免疫学系(Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada.)

6加拿大,不列颠哥伦比亚大学生物信息学研究生项目(Graduate Program in Bioinformatics, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada.)

7加拿大,不列颠哥伦比亚大学彼得·沃尔高级研究所(Peter Wall Institute for Advanced Studies, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada.)

8加拿大,不列颠哥伦比亚大学ECOSCOPE训练计划(ECOSCOPE Training Program, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada.)

9法国,巴黎萨克雷大学联盟巴黎第十一大学生态进化系(Ecologie Systématique Evolution, CNRS, Université Paris-Sud, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, 91400 Orsay, France.)

10日本,日本海洋与地球科学技术厅海洋生物科学研究与发展中心(Research and Development Center for Marine Biosciences, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology ,JAMSTEC, 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka 237-0061, Japan.)

11日本,地下地球生物学分析与研究部(Department of Subsurface Geobiology Analysis and Research, JAMSTEC, 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka 237-0061, Japan.)

12美国,能源部联合基因组研究所(Department of Energy Joint Genome Institute, Walnut Creek, CA 94598, USA.)

13荷兰,乌特勒支大学海洋微生物与生物地球化学系,荷兰皇家海洋研究所(Department of Marine Microbiology and Biogeochemistry, Royal Netherlands Institute for Sea Research, Utrecht University, 1790 AB Den Burg, Netherlands.)

写在前面

2017年11月24日在Science杂志发表了一篇文章,报道了在全球黑暗海洋中无机碳固定的主要参者。作者对数千个海洋原核生物的单扩增基因组(single amplified genomes)进行了测序,发现了超过30种通过亚硝酸盐氧化的专性化能自养细菌。它们能表达亚硝酸盐氧化还原酶且无法运输碳水化合物。该酶能提供电子以驱动逆三羧酸循环固碳。这些细菌一些基因组还表明其有能力产生铵和其它底物,去喂养含有亚硝酸盐合成代谢途径的伙伴。

摘要

在黑暗海洋中化能自养微生物的碳固定作用对全球碳循环和海洋内部的生态关系有重要影响,但这些微生物的主要类群和它们的能量来源仍是未知的。我们证明Nitrospirae中的亚硝酸盐氧化细菌对黑暗海洋的化能自养起重要作用。单细胞基因组学和群落宏基因组学揭示,Nitrospinae是全球海洋中丰度最高且分布广泛的亚硝酸盐氧化细菌。宏蛋白组学和宏转录组学分析表明,亚硝酸盐氧化是Nitrospinae产生能量的主要代谢途径。显微放射自显影术(Microautoradiography)与催化报告沉积荧光原位杂交技术(catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization)表明,Nitrospinae在北大西洋南部地区固定了15%-45%的无机碳。所以,亚硝酸盐氧化对碳循环的影响可能远大于人们以前的预想。

热心肠日报

https://www.mr-gut.cn/papers/read/1071198120

Science:亚硝酸盐氧化细菌在深海碳固定中的作用

创作:张玲 审核:沈志勋 2017年12月05日

原标题:亚硝酸盐氧化细菌在深海碳固定中的主要作用

  1. 采用16S rRNA基因PCR,筛选了39份深海氧合水团样本和2份海岸系统季节性贫氧样本中的细菌和古菌的3463个单扩增基因组(SAG);
  2. 单细胞基因组学和群落宏基因组学提示,海洋中Nitrospinae菌门是丰度最高、全球分布最广泛的亚硝酸盐氧化细菌(NOB);
  3. 宏蛋白质组和宏转录组学分析提示亚硝酸盐氧化是Nitrospinae菌门的最主要产能途径
  4. Nitrospinae菌门固定了北大西洋西部中远海15-45%的无机碳。

主编评语:
这是近期Science杂志发表的海洋微生物研究,明确了亚硝酸盐氧化细菌在深海碳固定中的主要作用。值得专业人士特别关注。

背景

真光层(sunlit surface layer)下的海水(即黑暗海洋)占海洋体积的90%,并且拥有地球上最大的微生物组之一。这些微生物对全球碳循环有重大影响,它们不仅能再矿化由浮游植物在真光层产生的有机物,还能通过化能自养固定无机碳。Marine group I(MG I)Thaumarchaeota,它们将氨氧化(ammonium oxidation)成亚硝酸盐,是黑暗海洋中已知最丰富的化能自养菌。然而仅靠氨氧化作用产生的能量不足以维持已测定出的碳固定速率。在北大西洋中已经发现未知菌系比Thaumarchaeota能更快地同化无机碳。越来越多的证据体表明,黑暗海洋里普遍存在的变形菌门中的SAR324,SUP05,ARTIC96BD-19,Agg47,和Oceanospirillales可以通过氧化还原态的硫化物和其它底物产能固定无机碳。然而,所有这些菌系的遗传特征都具有多样的代谢策略,包括异养性,且它们对黑暗海洋自养的实际贡献尚被未量化。

亚硝酸盐氧化细菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)有多个菌系,是潜在的化能自养菌,且其在海洋环境中仍知之甚少。已知的海洋亚硝酸盐氧化细菌包括从Nitrospinae(目:Deltaproteobacteria)和Nitrospirae以及Nitrobacter(Alphaproteobacteria)、Nitrococcus (Gammaproteobacteria)中培养分离得到的少量菌株。之前也有研究表明,Nitrospinae在黑暗海洋的一些地区丰度很高,且它们的丰度与亚硝酸盐氧化速率相关。

结果

在这里,我们通过单细胞基因组学和群落宏基因组学的研究方法对黑暗海洋亚硝酸盐氧化细菌的全球多样性,丰度和代谢潜力进行了系统分析。同时,我们估计了该类群对无光碳固定的贡献。我们利用PCR扩增16S rRNA基因,对3463个单扩增基因组(SAGs)进行筛选。这些单扩增基因组来自39个黑暗海洋含氧水团样品和2个季节性缺氧的海滨样品。其中98个SAGs被分类为Nitrospinae,4个被分类到硝化螺旋菌门(Nitrospirae),而NitrococcusNitrobacter未被检测到。Nitrospina gracilis是目前唯一分离培养获得的Nitrospinae,但本研究中所有Nitrospinae的都与它有差异(图1)。在98个Nitrospinae的单扩增基因组中,62个与最近提出的 “Candidatus Nitromaritim”(clade 1)聚为一支。剩余的36个单扩增基因组聚成了一支在此研究之前没有代表序列的新分支(clade2)。四个硝化螺旋菌门(Nitrospirae)单扩增基因组形成一个从Nitrospira marina中独立出来的海洋分支。为了研究海洋亚硝酸盐氧化细菌的代谢潜力,我们测序了30个Nitrospinae和4个Nitrospirae的单扩增基因组,这些基因组代表了单扩增基因组文库的各个系统发育分支和地理站点。组装结果中,最好的基因组完整度为90%,平均完整度为38%。我们还对240种深海细菌和古菌进行单扩增基因组测序,这些基因组代表了不同的类群,水团和地理位置。在这些单扩增基因组中都没有发现亚硝酸盐氧化还原酶基因,进一步表明Nitrospinae和小范围分布的Nitrospirae是海洋中的主要亚硝酸盐氧化细菌。

图1 非全长16S rRNA基因序列的系统发育树

image

Nitrospirae(橙色背景)和Nitrospinae(蓝色背景)非全长16S rRNA基因序列的系统进化树。

包括来自本研究测序的单扩增基因组(粗体),环境样品中的序列和之前研究报道的培养菌种。开放海域有氧水体中单扩增基因组用黑色表示; Saanich Inlet 单扩增基因组用蓝色表示。实心圆圈代表至少75%的bootstrap节点。外围的符号表示存在文中讨论的四个关键基因。圆中心比例尺代表估计的系统发育距离。由于分离菌种Nitrospira bockianaNitrospira salsaNitrospira marina尚未进行基因组测序,因此不能推断是否存在四种关键基因。

Phylogenetic tree of Nitrospirae (orange background) and Nitrospinae (blue background) partial 16S rRNA gene sequences.
Genomically sequenced SAGs from this study (in bold), environmental sequences, and cultivars reported in prior studies are included. Open-ocean oxygenated water column SAGs are indicated in black; Saanich Inlet SAGs are in blue. Nodes with bootstrap support of at least 75% are indicated as solid circles. The symbols on the periphery indicate the presence of the four key genes discussed in the text. The scale bar (center) represents the estimated phylogenetic distance. Because the isolates Nitrospira bockiana, Nitrospira salsa, and Nitrospira marina have not been genomically sequenced, the presence of the four key genes cannot be inferred.

亚硝酸盐氧化细菌平均占海洋中层样品中单扩增基因组的4.6%,在北大西洋中占比最高可达8.5%。亚硝酸盐氧化细菌在深海样品中平均占比2.6%,但在深渊单扩增基因组文库中相对丰度则下降至1.6%。在所有的真光层和超深渊样品中均未发现亚硝酸盐氧化细菌的单扩增基因组。然后,我们使用>95%的核苷酸一致性为阈值用己发表的宏基因组和亚硝酸盐氧化细菌基因组比对,鉴定相似reads。如图2所示,我们发现培养菌株基因组只招募到少量reads或者没有,因此这些类群不能代表海洋中占优势的亚硝酸盐氧化细菌。大多数亚硝酸盐氧化细菌的单扩增基因组的reads比对率较高(Nitrospirae大约高10倍,Nitrospinae大约高100倍)并显示出特定的模式(图2)。所有开放海洋Nitrospinae的单扩增基因组的招募表明其在全球分布,但对不同水深有偏好。来自Clade 1.a的单扩增基因组主要能比对上海洋中层的宏基因组,而Clade2.a的单扩增基因组主要能比对上来自深海、深渊和超深渊水层中的宏基因组。来自真光层的宏基因组显示出很少或没有可比对序列,除了少数例外(Clade 2.b单扩增基因组在宏基因组数据集108至120中得到很好的代表)。来自低氧区Saanich Inlet环境中的 Nitrospinae从其来源环境(Saanich Inlet的宏基因组)招募最佳且系统发育具有多样性,表明其低氧环境适应机制能在多个菌系中独立进化或在菌系中水平转移。四种Nitrospirae单扩增基因组对宏基因组片段的募集情况表明其没有明显的空间或垂直分布模式,仅成斑点状的地理分布。Swan等人使用单扩增基因组对宏基因组片段募集,在海洋浮游细菌的生物地理学中观察到明显的纬度分布模式。相比之下,我们使用类似工具研究表明,黑暗海洋中亚硝酸盐氧化细菌的全球分布没有纬度模式。一个看似合理的解释是在海洋光合层以下的水体缺乏由纬度差异造成的不同水温。相反,黑暗海洋中亚硝酸盐氧化细菌显示出垂直的生物地理分布格局,可能是由营养、氧气和静水压力的差异驱动

图2 通过募集宏基因组片段的方法确定亚硝酸盐氧化细菌单扩增基因组和培养菌种的全球分布

image

X轴代表参考基因组(单扩增基因组和培养品种,排序和来源见附表2),Y轴代表宏基因组。色标表示每个参考基因组的每兆碱基募集的宏基因组碱基的比例(%)。Y轴上的条形代表每个宏基因组能比对上所有单扩增基因组的碱基百分比。

Reference genomes (SAGs and cultivars) are listed along the x axis (order and sources in table S2); metagenomes are listed along the y axis (order and sources in table S4). The color scale indicates the proportion (%) of metagenome bases recruited per megabase of each reference genome. Percentages of aligned bases from each metagenome to all SAGs are presented as a bar plot on the y axis.

多种Nitrospinae和Nitrospirae的单扩增组装基因组包含三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶和其它能指示参与还原性三羧酸循环(rTCA)的碳固定基因(图1)。相比之下,碳水化合物转运蛋白基因在这些基因组中都没有被发现,没有提供异养的证据。糖异生和糖酵解的基因被检测到,但它们可能参与产生和利用糖原(NOB中已知的储能物质)。这些基因组结果与之前废水处理厂中的NOB培养菌株的实验结果一致,这表明有机底物既不支持 Nitrospina gracilisNitrospira moscoviensis的混养营养生长,也不支持其异养生长。如果被进一步的野外研究证实,海洋Nitrospinae和Nitrospirae是化能无机自氧的,会将它们从越来越多的海洋细菌和古细菌谱系中区分出来,而这些菌系最近被报道编码混合营养代谢途径。

我们在Nitrospinae和Nitrospirae单扩增基因组中检测到亚硝酸盐氧化还原酶的基因(图1),这与它们的培养研究一致,表明其有通过亚硝酸盐氧化产生能量的潜能。十个海洋NOB单扩增基因组中包含编码关键酶(亚硝酸盐氧化还原酶NxrABC)的三个亚基的单个操纵子,另外有NxrC的多拷贝分散分布。NxrA基因的系统发育树表明,海洋NOB具有这种酶的高亲和力类型。实验表明,携带高亲和力NxrA的NOB在亚硝酸盐浓度>20 mM的环境中受到抑制,只能在亚硝酸盐浓度低的培养基中培养。这可能在一般寡营养的海洋环境中是一种优势,并且可以解释Nitrospinae对NitrococcusNitrobacter的数量优势;后者被发现编码低亲和力的NxrA且需要更高浓度的亚硝酸盐。我们在NOB单扩增基因组测序结果中没有发现任何其它产能代谢途径的证据,如铵氧化,氢氧化(在Nitrospira moscoviensis中观察到),或硫化物的氧化。来自北大西洋和南大西洋的微生物群落的宏蛋白质组学分析显示,Nxr的亚基是最丰富的蛋白质之一,这可能就归因于NOB。在Saanich Inlet的缺氧水域中也观察到了类似的发现。同样,宏转录组学分析表明,Nxr亚基是2000米深的北大西洋、东地中海,Dolce湾和亚北极太平洋样品中表达量最高的转录本之一。总的来说,这一证据表明,主要的海洋NOB以亚硝酸盐氧化作为唯一的能量来源具有严格的特异性。

几种海洋Nitrospinae和Nitrospirae单扩增基因组中含有脲酶和氰酸盐水合酶/裂解酶基因(图1),它们分别将尿素和氰酸盐转化为铵和CO2。脲酶已在非海洋Nitrospirae中被报告过,而氰酸水合酶/裂合酶基因存在于已测序的NOB培养菌种中。脲酶操纵子在Nitrospinae单扩增基因组中高度保守,且包含尿素,支链氨基酸和寡肽的转运蛋白,表明共调节。操纵子的同线性和脲酶大亚基的系统发育表明Nitrospinae从Gammaproteobacteria水平转移获得这些基因,而Nitrospirae UreC是深度分枝的。有趣的是,Nitrospinae 氰酸酶基因与真核来源的氰酸酶聚集在一起。两个主要的海洋NOB菌系独立获得并保持尿素利用机制的事实是趋同进化的一个例子,也表明尿素利用对海洋NOB的重要性。我们在海洋优势NOB菌系中发现脲酶和尿素转运蛋白,表明NOB和铵氧化细菌(MG I Thaumarchaeota)(图3A)相互喂食在黑暗海洋中是可行的,尽管在一些海洋Thaumarchaeota的单扩增基因组中也发现了脲酶基因。基于编码氰酸盐水合酶/裂解酶的基因以及NOB中氨基酸和寡肽的转运蛋白的发现,我们推测类似的过程可能还涉及其它富含氮的底物。氰酸盐浓度与寡营养海洋环境中的铵盐浓度相当,迄今为止所分析的所有海洋Thaumarchaeota都缺乏氰酸盐水合酶/裂解酶基因。因此,对不同底物的相互喂食可能是海洋氮循环中一个被忽视的组成部分,值得进一步研究。

图3 亚硝酸盐氧化细菌和氨氧化古菌之间的潜在相互作用

image

(A)海洋亚硝酸盐氧化细菌和氨氧化古菌之间的互惠喂养假设示意图。

image

(B)从SAG微孔板AG-538的校准指数细胞分选估计的Nitrospinae(4个细胞)和Thaumarchaeota(58个细胞)的细胞直径

Potential interaction between nitrite-oxidizing bacteria and ammonium-oxidizing archaea.
(A) Schematic illustration of the hypothesized reciprocal feeding between marine nitrite-oxidizing bacteria and ammonium-oxidizing archaea.
(B) Cell diameter of Nitrospinae (four cells) and Thaumarchaeota (58 cells) estimated from calibrated-index cell sorting of SAG microplate AG-538.

我们的大量溶解无机碳(DIC)同化实验表明,暗化能自养率为0.03~10.37μmol C m -3 day-1,与先前在东大西洋和亚热带北大西洋的研究一致。为了估计NOB对碳暗固定的具体贡献,我们将来自六个站位的样品(图4A)与放射性标记的DIC(DI14C)一起孵育,然后进行微量放射自显影,针对Nitrospinae与催化的报告基因沉积荧光原位杂交相连(MAR-CARD-FISH)。我们发现Nitrospinae占海洋中层细胞固定DI14C的14~35%(图4B)。之前的研究表明,MAR-CARD-FISH银颗粒的面积与化学自养细胞固定的14C 线性相关。通过使用银颗粒面积(图4C)作为细胞特异性DI14C固定率的替代指标,我们估计Nitrospinae在海洋中层上部,下部和深海样品中分别贡献了25%-43%,15%-23%以及<10%的DI14C固定率(图4D)。Nitrospinae细胞特异性DIC固定率为 0.002 ~ 0.734 fmol C cell-1 day-1。在之前研究中,Varela等人使用类似的方法和样品在同一地理区域测定MG I Thaumarchaeota通过氨氧化固定DIC的效率。Nitrospinae溶解无机碳固定率高出MG I Thaumarchaeota一个数量级。

图4 Nitrospinae无光碳酸盐吸收野外实验

image

(A)样本采集站点的位置。

image

(B)吸收标记的碳酸氢盐的细胞中Nitrospinae的占比。

image

©左边的图像是透射光和荧光显微照片的叠加图,显示了用CARD-FISH(青色)标记的Nitrospinae细胞,其它细胞用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(白色)标记,银颗粒指示碳酸氢盐的摄取(深灰色斑点); 右侧的图像是单层透射光显微照片,以便更好地观察银颗粒。比例尺,55μm。

image

(D)Nitrospinae对研究样品中的无光碳酸氢盐同化的贡献评估。绘制最佳拟合曲线:y = -1092ln(x)-616.19; R2 = 0.80449。

Aphotic bicarbonate assimilation by Nitrospinae in field experiments.
(A) Locations of sample collection sites.
(B) Fraction of Nitrospinae among cells that assimilate labeled bicarbonate.
© Images on the left are overlays of transmitted light and epifluorescence micrographs showing Nitrospinae cells labeled by CARD-FISH (cyan), other cells labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (white), and silver grains indicating bicarbonate uptake (dark gray spots); images on the right are single-layer transmitted-light micrographs for better visibility of the silver grains. Scale bars, 5 μm.
(D) Estimated contribution of Nitrospinae to the aphotic bicarbonate assimilation in the studied samples. The best fitted curve is plotted: y = -1092ln(x)-616.19; R2 = 0.80449.

我们的研究结果与流行的假说(Thaumarchaeota在黑暗海洋的化能自养中占主导地位)相矛盾,但与之前报道的一些未知的细菌类群的DIC固定结果一致(在北大西洋中层,这些细菌是比古菌更重要的DIC固定贡献者)。流行的假设源于Thaumarchaea在黑暗海洋中数量占优势。然而,我们对细胞大小的测量表明,海洋Nitrospinae的生物体积比Thaumarchaeota大50倍图3B),与培养分离菌株的结果一致。因此,NOB和Thaumarchaea的累计生物体积在海洋的某些部分可能是相当的。此外,尽管氨氧化每次反应的理论产能比亚硝酸盐氧化的理论产能大3.7倍,但由于通过rTCA循环DIC固定消耗更小,Nitrospinae可能具有更高的代谢效率(2分子 ATP产1分子丙酮酸),与Thaumarchaeota的3-羟基丙酸酯/ 4-羟基丁酸酯循环(6至9分子ATP产1分子丙酮酸)相比。最后,NOB可以获得亚硝酸盐的补充来源,例如最近在SAR11中发现的部分反硝化作用,且SAR11是海洋中最丰富的浮游细菌进化枝。迄今为止,在黑暗海洋中NOB的化能自养被低估的一个因素可能是亚硝酸盐浓度通常非常低,这可能是NOB有效利用亚硝酸盐的结果。

通过对我们孵育实验中Nitrospinae在海洋中层DIC固定率进行平均,并将该值外推至海洋中层的整个体积,粗略估计全球海洋Nitrospinae每年大约固定1 Pg C。这与之前对黑暗海洋中固定的总碳估值(每年0.4~1.1 PG C)相似,低于从全球海洋上层估计的输出生产力一个数量级。作为比较,仅基于铵氧化的黑暗海洋碳固定的估计值要低一个数量级。尽管需要在地理范围更广泛的实验来完善我们的估算,但这些结果充分表明NOB(主要是Nitrospinae)对海洋内部的碳通量的影响比以前认为的要大

Reference

Major role of nitrite-oxidizing bacteria in dark ocean carbon fixation
BY MARIA G. PACHIADAKI, EVA SINTES, KRISTIN BERGAUER, JULIA M. BROWN, NICHOLAS R. RECORD, BRANDON K. SWAN, MARY ELIZABETH MATHYER, STEVEN J. HALLAM, PURIFICACION LOPEZ-GARCIA, YOSHIHIRO TAKAKI, TAKURO NUNOURA, TANJA WOYKE, GERHARD J. HERNDL, RAMUNAS STEPANAUSKAS
SCIENCE24 NOV 2017 : 1046-1051
https://science.sciencemag.org/content/358/6366/1046

作者简介

咖啡树,中国科学院大学18级博士生,主要研究方向:通过多组学方法研究极端环境下微生物的群落结构及其适应性机制

猜你喜欢

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难,我们建立了“宏基因组”专业讨论群,目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论,获得专业解答,欢迎分享此文至朋友圈,并扫码加主编好友带你入群,务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助,首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路,仍末解决群内讨论,问题不私聊,帮助同行。
image

学习扩增子、宏基因组科研思路和分析实战,关注“宏基因组”
image

image

点击阅读原文,跳转最新文章目录阅读
https://mp.weixin.qq.com/s/5jQspEvH5_4Xmart22gjMA

展开阅读全文

没有更多推荐了,返回首页