动物实验~No.2 组织染色

常规组织病理技术包括组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、H&E染色和特殊染色。通过对切片进行镜检或全扫分析，可以对组织的充血、水肿、变形、坏死、增生、纤维化、损伤修复程度进行评估，也可以进行蛋白质的定位表达分析、细胞增殖与凋亡分析、基因的原位表达分析。

组织染色（Histological Staining）是一种用于显微镜下观察和分析生物组织结构的重要技术。通过染色，可以提高组织切片的对比度，突出细胞和组织的特定成分，从而更容易识别和研究其形态和功能。

现就本菜菜狗实验中（可能）用到的组织染色方法浅浅记录一下，以便后续学习吼吼吼。

1. 石蜡切片、冰冻切片

定义

石蜡切片用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学研究与判断细胞组织形态变化的重要方法，同时广泛应用于其他学科的研究。冰冻切片在低温下快速冷冻组织以达到一定硬度后进行切片的方法，制作过程比石蜡切片更快捷简便，常用于手术中的快速病理诊断。

原理

组织固定后，含有大量水分，需使用从低浓度到高浓度的乙醇逐步置换水分，以便透明剂和石蜡的进入，称为脱水 → 脱水后，必须使用一种既能与乙醇相结合，又能溶解石蜡的溶剂，使石蜡能够通过该溶剂浸入组织，从而使组织变得透明，这个过程称为透明 → 经过脱水和透明处理后，组织用石蜡浸入以增加硬度并包裹组织，便于切片，这一过程称为浸蜡 → 最后，将浸蜡后的组织块用石蜡包裹，使其达到足够的硬度和韧性，利于切片。

技术干货

① 问题出在哪了呢？？？肿么办？？？

* 切片上卷或皱起 → 切片刀角度不合适（过大或过小），宜将角度调整为5°。

* 切片有空洞及破碎不齐 → 切片时慢一点，轻削组织。

* 切片有褶皱 → 切片时对准蜡块表面轻轻哈气。

② 小贴士(#^.^#)

* 组织过硬易碎裂，需软化或脱钙处理。
* 摊片时间过长会导致组织中心开裂。
* 摊片时间过短会使组织出现褶皱，影响染色和拍照。
* 特殊组织（如皮肤、脑组织）切片在染色过程中易掉片。
* 切片过厚会导致染色过深。

2. HE染色

定义

是苏木精-伊红染色法的简称，是最常用的染色方法。

原理

苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，可将细胞核中的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）则是阴离子染料，可将细胞质和胶原纤维染成粉红色。      助记：苏阳核碱蓝紫，伊阴胞质粉红

技术干货

问题出在哪了呢？？？肿么办？？？

* 染色易脱片
    - 组织破碎或过硬 → 使用防脱载玻片。
    - 脱水、透明不足 → 重新进行脱水、透明和浸蜡。
    - 脱水、透明过度 → 用酒精和甘油各半混合液浸泡切面后再切片。
    - 切片过厚 → 确保切片厚薄均匀。

* 切片染色不均
    -  取材固定不当 → 规范取材标准，确保固定彻底。
    -  脱水不够 → 重新进行脱水、透明和浸蜡。

* 切片染色模糊
    -  包埋蜡温度过高
    -  分化过度
    -  脱水、透明不彻底

4. IHC染色（Immunohistochemistry），即免疫组化

定义

是一种利用抗原抗体反应来检测组织切片中特定蛋白质或其他分子进行定位、定性及相对定量的方法。目标分子通常以抗原抗体复合物的显现出来。

原理

抗原-抗体反应是指抗原与抗体特异性结合的过程。通过这种反应，我们可以利用标记有荧光素、酶、金属离子或同位素的抗体进行显色，从而确定组织细胞内的抗原（如多肽和蛋白质），以此对抗原进行定位、定性和相对定量分析。

5. Tunel染色（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling）

定义

是一种用于检测细胞凋亡的技术

原理

TUNEL法通过利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)催化的机制，在细胞的DNA断裂处暴露的3’-OH末端加入荧光素 (FITC) 标记的dUTP（即荧光素-dUTP，fluorescein-dUTP）。这种标记允许利用荧光显微镜或流式细胞仪检测，并且能够有效识别和定量细胞凋亡事件。

6. 电镜检测

定义

是一种利用电子束代替可见光进行成像的高分辨率显微镜。

原理

超微病理利用电子显微镜的高分辨率，揭示了光学显微镜无法观察到的细胞膜、细胞质内各种细胞器以及细胞核的微观结构和病理变化，并进行详尽研究。

7. RNA荧光原位杂交（RNA Fluorescence In Situ Hybridizaton）

定义

简称RNA FISH，是一种分子生物学技术，用于定位和检测细胞或组织中特定RNA序列的位置和数量。

原理

通过使待检细胞或组织切片上的靶核酸与核酸探针互补结合，经‘’变性-退火-复性‘’，利用核酸探针上的特殊标记（如生物素或荧光素）进行免疫化学或荧光检测，实现对待检核酸（如mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA）的定性、半定量或相对定位分析。

8. TTC染色（Triphenyl Tetrazolium Chloride）

定义

是一种常用的生物学染色技术，用于评估细菌的代谢活性和活细胞数目，是评价脑缺血损伤常用的指标。

原理

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是一种脂溶性光敏感化合物，用于检测哺乳动物组织中的缺血情况。在正常组织中能与脱氢酶反应生成红色产物。然而，在缺血组织中，由于脱氢酶活性下降，TTC不能发生反应，导致染色结果呈现苍白色。

用途

通过 TTC 染色观察梗死病变及梗死体积。

技术干货

* TTC 染色应全程避光。

* 动物取材不需要灌流取材，直接取出大脑。脑组织较软，取材时要注意保证大脑的完整性。

* 在做脑槽切片时，提前将脑子冻一下更好切，不易损坏。

* 染色过深或过浅可能和染色时间有关，可适当调整。

注：文章参考源于TTC染色__病理染色外包公司_普拉特泽生物 (uptbio.com)及TTC染色-TTC 染色实验（TTC）-丁香实验 (biomart.cn)

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2024623~且行且行 菜菜狗 的 动物实验第②篇小笔记