WB实验二三事｜实验讨论，疑惑整理，问题解析Ai辅助答疑

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WB（Western Blot）实验是生物化学和分子生物学中常用的一种实验技术，但在实验过程中会遇到各种各样的问题。比如：“蛋白条带模糊不清是怎么回事？”“转膜效率低下如何解决？”“显影后背景过高该怎么办？” 这些问题困扰着许多实验人员，影响实验结果的准确性和可靠性。

查找真人经验

当实验相关原理啊，步骤流程等事宜不清楚的时候，我们可以通过以下途径来解决问题

学术交流平台：在丁香园、小木虫等学术论坛上，有大量关于 WB 实验问题的讨论帖。实验者们分享自己在实验中的遭遇，如某个抗体总是出现非特异性条带，或者在特定样本中蛋白无法正常显色等情况。
实验室内部交流：与同实验室的师兄师姐、同事交流。他们在长期的实验过程中积累了丰富的经验，比如有的同事知道在处理某些特殊蛋白时，样品准备过程中的特殊注意事项。
科研讲座与培训：参加 WB 实验相关的讲座和培训，培训老师会分享一些常见问题及解决方法，同时在交流环节能听到其他科研人员的问题。

整理结合疑惑点

查找完资料，对某些步骤或者问题存疑或者总结发现看法不一，怎么办呢？那可以试试把资料、观点总结、自己的理解结合在一起，让AI 帮忙分析一下，自己再进行判断正误。

整理资料：将从论坛、实验室交流和讲座中获取的信息进行分类整理。例如，把关于蛋白样品制备环节的问题归为一类，转膜环节的问题归为另一类。
分析疑惑点：在整理过程中发现，对于某些问题大家的看法并不一致。比如在解决背景过高问题上，有人认为是封闭液的问题，而有人觉得是洗膜不充分。这些争议点自己判断不了的时候，可以咨询行学AI 解析关键疑惑。

AI 解析细节实验问题，配图 AI 问答

那为什么要用AI，AI可以帮助处理哪些问题呢？实验做完前-中-后有问题不会分析的时候，都可以找 AI 一起解读、分析及优化。

选择合适的 AI 工具：使用专门的生物医学科学领域的知识问答 AI 或者通用的大型语言模型，就比如：行学AI就是以医学科研者为目标群体，致力于辅助医学科研的一款AI软件。

输入疑惑点：将诸如 “背景过高且封闭液已更换多次仍未解决” 这样的疑惑点准确输入 AI。又或者是细节问题如 WB 实验中的一些细节，如加样时枪头的角度、电泳时电压电流的细微调整等问题，可以详细向 AI 询问。实验结果分析：当完成 WB 实验后，如果得到的结果不理想且自己无法准确分析时，将整个实验的操作流程、结果图像等信息提供给 AI。

获取 AI 答案：AI 可能会从多个角度分析，如可能提出检查实验环境温度湿度是否影响封闭效果，或者考虑是否存在交叉反应的可能性。
评估可靠性：如果 AI 答案与多数真人经验相符，且有合理的科学依据，那么其可靠性较高。若存在差异，可以通过进一步查阅文献或者设计新的实验来验证。
细节问题呈现：对于 WB 实验中的一些细节，如加样时枪头的角度、电泳时电压电流的细微调整等问题，可以详细向 AI 询问。
配图辅助理解：使用实验操作图、蛋白结构示意图等相关图片来帮助 AI 更好地理解问题。例如，向 AI 展示模糊蛋白条带的图片，询问可能的原因。AI 可以根据图像信息结合文字描述给出更准确的答案。
优化建议：AI 可以根据这些信息指出可能存在问题的步骤，比如在某个蛋白的上样量是否准确，或者是显色步骤的时间把控是否合适等，并给出优化下一次实验的建议。

下面是用行学AI进行解答的案例，可以参考。

在行学AI输入question: WB实验背景过高问题上，有人认为是封闭液的问题，而有人觉得是洗膜不充分。运用WB专业知识进行解读分析，给出答案及该问题的实验修改操作建议

行学AI解析:

一、背景信号过高的原因分析

封闭液问题
- 封闭液的选择：
  不同的封闭液在限制非特异性结合方面效果不同。常见的封闭液包括：
  - 脱脂奶粉：其成分可能会干扰某些抗体的结合，但对大多数实验来说通常是一个合适的选择。若是对细胞或组织提取物进行抗体检测，可能会有背景信号问题。
  - BSA（牛血清白蛋白）：相对较纯，可以有效地减少非特异性结合，适合对特异性要求高的实验。
  - 鱼明胶和专用封闭液：针对特定实验设计的封闭液通常能更有效地控制背景。
- 浓度：
  封闭剂的浓度过低可能无法完全覆盖膜上的活性位点，导致背景信号高。一般推荐的脱脂奶粉浓度为5%-10%，而BSA的浓度通常在1%-5%之间。
- 封闭时间与温度：
  封闭时间短或温度不合适，使得膜未充分覆盖，可能导致抗体与非特异性位点结合。封闭一般建议在室温下进行1小时或在4°C下过夜。
洗膜不充分
- 洗涤缓冲液的选择与浓度：
  - 洗膜缓冲液（如PBST）中Tween-20的浓度通常应在0.1%到0.5%之间。浓度过低会导致未结合抗体残留在膜上，增加背景信号。使用PBST而非PBS能够有效减少背景。
- 洗涤次数与时间：
  洗涤步骤应当充分，建议初步洗涤3-5次，每次5-10分钟。洗涤时间和频率不够会导致未结合的抗体残留，增加背景。
- 洗涤温度与方式：
  使用温水洗涤可能帮助更好地去除未结合的抗体，并且轻轻摇动洗涤槽能提高洗涤效率。
抗体优化
- 抗体浓度：
  使用过量的一抗和二抗是导致背景信号升高的重要原因。抗体浓度过高时，零星的非特异性结合也会被放大。需优化一抗和二抗的稀释比例，通常推荐从1:500到1:5000开始调整，寻找最佳信号对比。
- 抗体来源与特异性：
  确保所用抗体的特异性，低特异性抗体会非特异性结合，导致背景信号增加。使用的抗体必须经过验证，确保其在目标蛋白和背景之间具有良好的区分能力。
膜类型与处理
- 转膜材料：
  PVDF膜通常提供更好的信号强度和更少的背景，而硝酸纤维素膜在特定条件下也表现良好。使用不合适的膜会影响信号和背景。
- 膜的预处理：
  如果膜在转移前未进行预处理（如醇处理），可能会导致蛋白质结合不均，从而增加背景。

二、实验修改操作建议

封闭液的优化：
- 尝试不同的封闭液组合（如1% BSA与5%奶粉混合）进行封闭，以求降低背景。
- 增加封闭时间，尤其是在4°C下进行过夜封闭。
完善洗涤步骤：
- 增加洗涤轮数与时间，如在抗体孵育后，设置3-5次洗涤，每次10分钟，确保充分去除未结合的抗体。
- 确保洗涤液中Tween-20浓度达到0.1%-0.5%。
- 使用新鲜的PBST，并保持洗液温和，尽量轻轻搅动以提高洗涤效果。
抗体稀释与使用：
- 进行抗体滴定实验，从较低浓度开始，然后逐步增加，以找到最佳浓度，以降低背景信号。
- 回顾抗体的来源和特异性。如果抗体的特异性不足，考虑更换抗体。
膜处理与使用：
- 确保使用的膜适合实验需求，可以选择PVDF膜并準备充分。
- 验证膜的预处理步骤，确保其在转移过程中完全活跃。
对照组：
- 在实验设计中设置对照组（如未用抗体的膜），以便于评估背景信号的来源。通过对照组，可以更明确地判定背景信号的来自哪个步骤。