ANNOROAD0922
生物信息学练习题
一、data/newBGIseq500_1.fq和data/newBGIseq500_2.fq中是基于BGIseq500测序平台的一种真核生物基因组DNA的PE101测序数据，插入片段长度为450 bp；已知该基因组大小约在6M左右。
1） 请统计本次测序的PE reads数是多少对reads？理论上能否使基因组99%以上的区域达到至少40X覆盖？请简要写出推理和计算的过程与结果，数值计算使用R等工具时请写出所用代码。
代码：
1、 wc -l data/newBGIseq500_1.fq|awk '{print $1/4}'
1599999
2、
参考1
根据上一步结果计算全部的数据量
base<-1599999*200
计算平均深度，深度符合泊松分布（理论上），平均深度即其的期望
dep<-base/6000000
计算当前情况，深度大于40X的区间的百分比。
print (ppois(40,lambda=dep,lower=FALSE))
[1] 0.9650074
理论上不能使基因组99%以上的区域达到至少40X覆盖
参考2：
genome <- 6e6
read_length = 100
number_reads <- 6399996/2
depth = read_length * number_reads / genome
print(1- ppois(39 , depth))
[1] 0.975145
参考3：
根据上一步结果计算全部的数据量
base<-1599999*200
计算平均深度，（理论上(最简单的理解，不考虑服从的分布情况)），平均深度即其的期望
dep<-base/（6000000*0.99）
dep >40
理论上能使基因组99%以上的区域达到至少40X覆盖
结题思路：
1、 fq每四行表示一条reads的信息，1.fq和2.fq是成对存在的
2、 通过PE101、reads对数计算得到总碱基数，与6M基因组大小的99%的区域40X以上需要的碱基数作比较即可
2） 请下载并安装SOAPdenovo软件，设置-K参数为35对该数据进行de novo组装，并画出组装结果序列从长到短的长度累积曲线图；
下载地址：
https://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/latest/download
安装：
make
配置文件：
#maximal read length
max_rd_len=100
[LIB]
#average
insert size avg_ins=450
#if sequence needs to be reversed
reverse_seq=0
#in which part(s) the reads are used
asm_flags=3
#use only first 100 bps of each read
rd_len_cutoff=100
#in which order the reads are used while scaffolding
rank=1
cutoff of pair number for a reliable connection (at least 3 for short insert size)
pair_num_cutoff=3
#minimum aligned length to contigs for a reliable read location (at least 32 for short insert size)
map_len=32
#a pair of fastq file, read 1 file should always be followed by read 2 file
q1=/home/stu27/data/newBGIseq500_1.fq
q2=/home/stu27/data/newBGIseq500_2.fq
命令执行
/home/stu27/soapdenovo/SOAPdenovo2-master/SOAPdenovo-63mer all -s /home/stu27/test/soapdenovo/example.config -K 35 -R -o output 1>ot1.log 2>ou1.err
提取序列长度：
脚本内容：
#usr/bin/perl -w
use strict;
$/=">";
my %hash;
open(IN,"output.scafSeq") or die $!;
while(<IN>){
next if(/^$/||/^>/);
my $line=$_;
my ($name,@seq)=split /\n/,$line;
my $list=join("",@seq);
my $seqname=(split/\s+/,$name)[0];
my $length=length($list);
$hash{$seqname}=$length;
# print "$seqname\t$length\n";
}
foreach my $key (sort { $hash{$b} <=> $hash{$a} } keys %hash ){
print "$key\t$hash{$key}\n";
}
执行
perl $0 >length.txt
长度作图：
接上面perl生成的length.txt。
pdf("length.pdf")
lens <- read.table("length.txt")
pdata <- cumsum(lens[,2])
plot(pdata,type="l",ylab='Total length',xlab = 'Seq num')
dev.off()
示例1：
> qual <- read.table("length.list")
> pdf("Length.pdf")
> qual<- ftable(qual)
> qual <- as.data.frame(qual)
> qual$per <- qual$Freq/sum(qual$Freq)
> aa <- sort(qual[,1],decreasing = T)
> aa <- as.data.frame(aa)
> aa$per <- as.data.frame(rev(qual[,3]))
> sum <- 0
> accu <- list()
> for(i in 1:nrow(aa)){ sum = sum + aa[i,2] ， accu[[i]] = sum }
> aa$accu <- t(as.data.frame(accu))
> plot(x = aa[,1],y = aa[,3],type="o",col ="red",xlab ="length",ylab ="percentage",main="accuWarning message:ld")
> dev.off()
示例2：
png("length.png")
data<-read.table("zzz",head=F)
colnames(data)<-c("length")
pdata<-table(data$length)
pframe<-data.frame(as.numeric(names(pdata)),as.numeric(pdata))
colnames(pframe)<-c("length","num")
rankData<-pframe[order(pframe[,1],decreasing=T),]
mulData<-data.frame()
sum=0
for(i in 1:nrow(rankData)){ sum=sum+rankData[i,2] row=cbind(rankData$length[i],sum) mulData=rbind(mulData,row) }
colnames(mulData)<-c("length","num") plot(mulData$length,mulData$num/sum,main="序列长度累积曲线图",xlab="长度",ylab="累计比例",type="l")
axis(side=2,seq(from=0,to=1,by=0.1),) #axis(side=1,seq(from=36000,to=300000,by=10000),) dev.off()
3）计算组装结果的N50。
perl -e 'my ($len,$total)=(0,0);my @x;while(<>){if(/^[\>\@]/){if($len>0){$total+=$len;push@x,$len;};$len=0;}else{s/\s//g;$len+=length($_);}}if ($len>0){$total+=$len;push @x,$len;}@x=sort{$b<=>$a}@x; my ($count,$half)=(0,0);for (my $j=0;$j<@x;$j++){$count+=$x[$j];if(($count>=$total/2)&&($half==0)){print "N50: $x[$j]\n";$half=$x[$j]}elsif($count>=$total*0.9){print "N90: $x[$j]\n";exit;}}' output.scafSeq
N50: 40176
N90: 3782
二、考试参考目录下文件data/chr17.vcf.gz，中是某trio家系的17号染色体的变异集合，参考序列为hg38。
1） 编写脚本或选择适当工具，统计vcf中变异位点的Qual值分布情况，并画图展示。
提取qual值
/home/stu27/vcftools/vcftools_0.1.13/bin/vcftools --gzvcf chr17.vcf.gz --out Qual --site-quality
作图：
> data <- read.table("Qual.lqual",header = TRUE)
> pdf("Qual.pdf")
> hist(data[,3],main = "Qual Hist")
> dev.off()
2） 选择合适的工具或方法提取该家系在TP53基因上是变异情况进行输出，并说明变异位点的数目以及各样品的情况（纯合、杂合位点数目）。
/home/stu27/vcftools/vcftools_0.1.13/bin/vcftools --gzvcf chr17.vcf.gz --chr chr17 --to-bp 7687550 --out TP53 --recode --from-bp 7661779
TP53位置信息：
Chromosome 17: 7,661,779-7,687,550
该区域中包含的变异位点的脚本：
#!/usr/bin/perl
use strict;
use warnings;
my @sample;
my %hash;
open (IN,"chr17.vcf") or die $!;
while (<IN>) {
chomp;
next if (/^##/);
my $line=$_;
if ($line=~/^#CHROM/) { (undef,undef,undef,undef,undef,undef,undef,undef,undef,@sample)=split/\t/,$line;
next;
}
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT 27DMBDM4YT 7XKZJA3JWX APRDKV0LDS
my ($chrom,$pos,$id,$ref,$alt,$qual,$filter,$info,$format,@Other)=split/\t/,$line;
if ($pos>=7661779 && $pos <=7687550){
for (my $i=0;$i<@sample ;$i++) {
my $lis=(split/:/,$Other[$i])[0];
my ($aa,$bb)=split/\//,$lis;
if ($aa == $bb) {
if (exists $hash{$sample[$i]}{'aa'}) {
$hash{$sample[$i]}{'aa'} +=1;
}else{
$hash{$sample[$i]}{'aa'}=1;
}
}else{
if (exists $hash{$sample[$i]}{'ab'}) {
$hash{$sample[$i]}{'ab'} +=1;
}else{
$hash{$sample[$i]}{'ab'}=1;
}
}
}
}
}
close IN;
print "#Sample\tHomozygous\tHeterozygote\n";
foreach my $name (keys %hash) {
print "$name\t$hash{$name}{'aa'}\t$hash{$name}{'ab'}\n";
}
#Sample Homozygous Heterozygote
27DMBDM4YT 53 12
APRDKV0LDS 53 12
7XKZJA3JWX 13 52
答题要求：
请在答题目录下新建一个名为“exam”的目录，并在其中建立2个子目录： “1_SOAPdenovo”、“2_Trio”，将该题目的解答依次保存在子目录中。
需要用到的软件：SOAPdenovo、Jellyfish、VCF操作工具、R等等请自行安装。
请将解题思路与信息查询、参考序列、软件下载地址等非脚本运行的步骤在result.txt文件中进行说明，可运行命令保存在01_work.sh、02_work.sh中，其他程序、脚本、输出文件等按需要命名。
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