文献精读 A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19-CSDN博客

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A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19

Wilk AJ, Rustagi A, Zhao NQ, et al. A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19. Nat Med. 2020;26(7):1070-1076. doi:10.1038/s41591-020-0944-y

写在前面系列简介

今天分享的是一篇新冠相关单细胞的文献, 也是这一系列的第一篇, 以后争取更新频率高于一周一篇. 另外由于翻译水平有限的原因, 大概率会有很多中英混杂. 本系列的目的首先是锻炼一下自己英文读写和翻译的水平, 其次才是关注一下最新的文献啦~

本文是2020年6月在nature medicine (IF=36.130) 发表的研究在Severe的COVID-19患者中外周免疫(peripheral immune)的图谱. 同时作者对于所用的数据库给出了一个门户网站(www#covid19cellatlas#org) 对数据分析感兴趣的同学可以自行尝试.

这篇文章大约在6月底, 8月中, 和近期读了三遍, 每次读都有新的收获. 认真写完这篇文章大概用了三个晚上, 自己收获很多~ 以后应该会坚持这样分享文献精读.

0x00 About Author

Aaron J. Wilk (First Author)

MD/PhD of Immunology at Stanford University School of Medicine

Bachelor of Science (B.S.)Biology, Chemistry, and Music

主要研究领域: NK细胞

Catherine A. Blish(Corresponding Author)

MD/PhD at Stanford University School of Medicine

Her lab works on clinical immunology and focuses primarily on the role of the innate immune system in fighting infectious diseases like HIV, dengue fever, and influenza. Her immune cell biology work characterizes the biology and action of Natural Killer (NK) cells and macrophages.

0x01 Abstract

文章开头首先按照国际惯例介绍COVID-19的严重性, 导致的伤亡人数等. 特别地, 有约20%的患者会发展至severe, 并有5%的患者要进行危重护理(intensive care). 重症患者可能与外周的免疫反应(peripheral immune activity)相关, 这些反应包括某一亚群单核细胞(monocyte)分泌的促炎症细胞因子水平升高(increased levels of pro-inflammatory cytokines), 淋巴细胞减少症(lymphopenia), 和T细胞耗竭(T cell exhaustion).

为了说明那些可能引起免疫病理学(immunopathology)和保护性免疫(protective immunity)的外周免疫通路(pathway)变化, 作者对七名住院的(hospitalized)病人和六名健康人的外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) 进行了sc-RNA seq测序. 其中四名病人并发有急性呼吸衰竭(acute respiratory distress syndrome).

对于样本进行重新降维聚类分群后, 定义了外周免疫细胞的重构表型(reconfiguration of peripheral immune cell phenotype), 这些特征包括一种异质性的干扰素刺激基因(heterogeneous interferon-stimulated gene), HLA II 表达下调(HLA class II downregulation), 以及在呼吸机支持(mechanical ventilation)的ARDS患者中一群类浆母细胞(plasmablast)的中性粒细胞(developing- neutrophil).

总的来说, 作者在构建severe COVID-19患者的单细胞图谱后, 发现了在外周血的单核细胞和淋巴细胞中没有表达足够的促炎症细胞因子.

0x02 正文

作者在7名RT-PCR确认新冠阳性的患者和6名健康被试(asymptomic)分别取了8个外周血样本. 对于COVID-19 positive的患者信息如下:

Fig.1a 患者的临床信息统计(Demographics)

患者的年龄选取为随机的, 且均为男性(?), 给出了出现症状和发烧的时间. 其中C1, C3, C4患者注射了阿奇霉素(Azithromycin), 作者认为Azithromycin可能会导致免疫调节效应(immunomodulatory effect), 除C7以外患者均在ICU, 部分采样时患者有呼吸衰竭或瘫痪(paralyzed)症状. 最终C6病人去世, 其余大多患者康复出院. 作者提到Remdesivir的用药情况[注: Remdesivir一度被认为可以治疗新冠, 但没有明确依据表明其对新冠有治疗效果.]

文章一共采集了44,721个细胞, 平均每个样本有3,194个细胞. 作者聚类UMAP进行降维, 分群得到了30个cluster, 并通过计算各cluster的Marker进行了手动注释. 从GitHub上找到了这几个图的源代码, 具体的数据处理细节会在文章后半部分提到.

Fig.1b,1c Dimensinality reduction by UMAP. Grouped by samples and cell type.

从Fig.1b,1c可以看出, 患者(红黄色调)与健康被试(蓝色调)在UMAP图上有显著的区分, 参考Fig.1c可以发现, 这些差异主要体现在monocyte, T, NK细胞亚群. 接下来作者发现, 一些种类的固有免疫细胞(innate immune cell)亚群如 $\gamma\delta$ T, pDC(plasmacytoid dritic cell), cDC(conventional dritic cell), CD16⁺Monocyte, NK细胞在新冠病人中有显著的减少, 对此作者是将样本分为健康, 无需呼吸支持的新冠病人, 需要呼吸支持的新冠病人三组. 绘制了barplot计算了P-value(Fig.1d). 可以发现需要呼吸支持组的Developing neutrophil, CD16⁺Monocyte, DC, pDC, $\gamma\delta$ T, NK, B等亚群均有较大差异. 作者也将症状后时间和发烧时间进行了类似的比较, 但均未发现明显差异. 对于各组plasmablast在呼吸支持的患者中显著升高的表现, 也与之前报道的重症患者具有更强的体液免疫应答(more robust humoral immune response)相一致. 但作者也对PB的V基因进行了测序, 发现各患者间的V基因序列并不相同(did not appear to share particular immunoglobulin V genes).

Fig.1d 分组Barplot比较各组各类细胞的占比.(PB stands for PlasmaBlast)

在进行分群注释时, 作者注释了一群Developing Neutrophil的细胞, 这群细胞仅在呼吸衰竭病人中显著增加. 这一群细胞表达中性粒细胞中存在蛋白的基因如ELANE, LTF, MMP8, 但不表达一些常见的Neu的marker如FCGR3B, CXCR2等, 在UMAP图(Fig.1c)中位于PB附近而非Neu亚群附近. 此外这一亚群周围的细胞表达最近报道的Pro-Neu(neutrophil progenitors)细胞的marker如ELANE, CEACAM8, LYZ等. 作者据此认为这些细胞是处于发育阶段的中性粒细胞.

接下来作者进一步提取Monocyte进行深入的研究, 重进进行降维聚类分群得到新的UMAP(Fig.2a,2b). 并通过CD14和FCGR3A(编码CD16a蛋白的基因)来区分CD14⁺Mono和CD6⁺Mono, 并选择 HLA-DPB1, HLA-DMA研究HLA II下调的情况, 选择S100A9, IFI27来研究典型的炎症特征(canonical inflammatory signatures). 作者发现, 单独提取monocyte比较, CD16⁺的细胞数量较少. 作者比较常见的促炎症细胞因子基因(Pro-inflammatory cytokine genes)(TNF, IL6, IL1B, CCL3, CCL4 or CXCL2)发现这些基因表达量均较低(Fig.2c), 表明外周血的单核细胞并非导致炎症风暴(cytokine storm)的来源, 而以往新冠的炎症风暴往往被认为是由外周单核细胞导致的.

Fig.2a,2b,2c 提取monocyte亚群后重新绘制UMAP和一些marker的FeaturePlot.

为了进一步研究这些表型(phenotypic)变化的差异, 作者将新冠患者与健康被试的单核细胞寻找差异表达基因, 如图Fig.2d表明编译HLA class II的基因显著下调, 这与现有的研究一致. 在细胞通路的比较中,发现在DC和NK细胞间的细胞通讯(crosstalk between dendritic cells & natural killer cells)显著降低. 此外在B细胞中也观察到了关于HLA class II基因下调的情况. 以上下调情况作者发现与年纪有一定关联, 年长的患者下调程度较高. 个别样本中还有非典型的HLA class I(Non-classical HLA class I)如HLA-E, HLA-F. 其余典型HLA class I基因没有显著变化.

其他一些基因如干扰素基因(IFN), 干扰素调节因子(IFN regulatory factor, IRF)干扰素刺激基因(interferon (IFN)-stimulated genes, ISGs)也有一些差异, 但差异不统一(uniform)或不显著. 特别由Fig.2h发现C2, C3, C7患者有许多干扰素相关基因表达量较低, 为了研究这一情况, 取出样本的CD4⁺Monocyte, 进行ISG相关基因打分Fig.2i, 但ISG相关基因得分差异与呼吸衰竭及新冠分组无明显关联, 作者提出与年龄等因素有关, 但p-Value并非如此可信如Fig.2j.

Fig.2d,2g,2h 对患者的差异表达基因和富集通路情况绘制heatmap

Fig.2j ISG基因得分与年龄, 发烧市场的相关关系, p_age=0.097,p_fever=0.14.

对分组后的细胞进行单细胞评分, 评价所有HLA class II相关编码基因情况Fig.2e,2f, 发现患者的得分显著降低, 特别在发生呼吸衰竭的患者组中更为明显.

Fig.2e,2f,2i 分组进行单细胞评分(Scoring of individual cells by expression).

接下来作者转而分析T细胞和NK细胞, 可以发现在UMAP中Fig.3aCD4⁺和CD8⁺T及NK细胞有十分明显的区分.

Fig.3a,3b 对T, NK细胞重新划分并染色相关marker, NCAM1是编码CD56, FCGR3A编码CD16 .

作者特别关注到了CD56(由NCAM1编码)在NK细胞的表达. 过去的研究认为CD56^dimNK细胞有通过细胞介导的细胞毒性抗病毒作用(antiviral host defense through cell-mediated cytotoxicity), 而CD56^brightNK细胞可以产生大量IFN- $\gamma$ 与TNF- $\alpha$ . 作者观察到CD56^dimNK细胞在呼吸衰竭组有显著降低, 而CD56^brightNK细胞在新冠病人中均有显著降低. 此外增殖性淋巴细胞(Proliferative Lymphocytes)在新冠患者中有显著增加.

Fig.3c 分组后观察CD56^dimNK, CD56^brightNK细胞 .

现有研究认为, 新冠肺炎感染与细胞毒性淋巴细胞的耗竭(cytotoxic lymphocyte exhaustion)有关, 作者接着研究了T与NK细胞耗竭的典型基因表达情况. 作者发现在CD4⁺T细胞中这一类基因表达有所升高但不明显, CD8⁺T细胞中没有发现相关基因的变化. 在NK细胞中, 新冠组有显著的NK细胞耗竭的表现Fig.3d, 高表达NK耗竭基因LAG3, PDCD1, HAVCR2.

Fig.3d 分组后观察NK细胞耗竭情况 .

与前一部分相似, 作者也没有在NK和T细胞中找到促炎症细胞因子(pro-inflammatory cytokines)的高表达情况. 进而排除了NK和T细胞在新冠导致的炎症风暴的情况. 继续对NK和T细胞的差异基因进行比较.发现外周血中与NK细胞成熟相关的基因FCGR3A, AHNAK, FGFBP2有显著下调, ISG基因与NK细胞激活基因如PLEK, CD38却有显著上调. 在CD4⁺T和CD8⁺T细胞中也观测到了类似的ISG基因上调的现象. 而之前预测的IFN响应在大多数T, NK细胞中没有观察到(Fig.3g). 而作者认为, ISG相关基因表达上调(Fig.3h)才是影响相关反应的关键, 而非之前报道的IFN相关基因.

Fig.3f,3g,3h,3i 研究各组NK及T细胞基因上下调与通路情况, 及ISG相关基因的表达(h,i)

作者在此做了小结, 认为ISG相关的基因尽管在某些患者中体现了一定的共上调情况, 但其上调与表达仍然是十分复杂的, 对于不同样本其上调机制也没有明显规律, 也无法给出清晰的解释.

接着还剩最后一群细胞了, PlasamaBlast, PB与作者定义的Developing Neutrophil, Dev. Neu. , 走流程重新降维分群, 显示出Dev. Neu. 在UMAP上显示了类似线性的关系. 作者还自然的想到, 既然Dev. Neu. 同时表现Neu和PB的特性, 会不会是两种细胞混杂呢? 作者通过QC时给出的Complexity数据(即UMI per cell)发现, Dev. Neu.的complexity都较低, 排除了多种细胞混合的可能. 另一种可能是这些细胞是吞噬了B细胞的套娃粒细胞(granulocytes that have phagocytosed B cells), 这种粒细胞吞噬B细胞的现象是一种称为“噬血细胞淋巴组织细胞增生症”(hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)的表现, 这一疾病可能是某些严重感染的并发症, 但从临床信息中判断这几名患者均没有罹患这一疾病.

Fig.4a,4b 重新降维得到的PB与Dev.Neu.图, 及相关marker .

为了进一步弄清楚这些细胞间可能存在的转换, 作者使用RNA velocity进行了细胞轨迹分析(cellular trajectory analysis)见Fig.4a. 作者意外的发现, 定义的这些Dev. Neu. 是由PB分化而来, 且这一PB向Dev. Neu.的转换在所有呼吸衰竭的患者样本中都有观察到, 这一转换也与典型的中性粒细胞的发育不同, 在UMAP图上相隔很远相互无联系. 通过染色Fig.4b发现, 这些Dev.Neu.不表达常见的PBmarker如CD27, CD38 and TNFRSF17, 但相反的依次表达了三个阶段的中性粒细胞的marker如DEF3A, ELANE and MPO(primary), CHI3DL1, LCN2 and LTF(secondary), MMP8, MMP9 and CAMP(tertiary), 这些蛋白的表达与常规的中性粒细胞发育相一致.

Fig.4c,4d,4e,4f 推断发育时间(inferred latent time)

作者还原了细胞转录顺序, 如Fig.4c的推断时间(inferred latent time)表明, Dev.Neu.是最后发育成的. 同样也根据推断时间(Latent time) 观察了一些中性粒细胞marker如CSF3R, MNDA的表达情况Fig.4d证实了上述转化顺序的结论.[注: 这里Fig.4d中有两个MPO基因也许是图片误用, 还没来得及去查wilk *et al.*的源代码这一部分生成情况]

之前也有过一些报道称淋巴细胞会向粒细胞的分化过程. 如B细胞可能分化为巨噬细胞或粒细胞, C/增强子转录蛋白因子家族(C/enhancer binding protein,EBP, transcription factor family)被认为控制这一分化过程. 这一家族的两个成员CEBPD和CEBPE在J和K亚群中高表达, 这两个基因已有研究控制鼠(mouse)中性粒细胞的发育.

至此, 作者观察到了在新冠肺炎病毒重症感染的呼吸衰竭的病人中, 有发育-中性粒细胞(Developing Neutrophil)的存在, 虽然经分析这些粒细胞来源于浆母细胞(plasmablasts), 但作者认为这中分化路径也是受紧急生成粒细胞(emergency granulopoiesis)的指令调控.

当然作者在最后也提出了一些工作的局限性, 如样本较少, 采样补位单一, 部分患者使用了阿司匹林而另一些用了瑞德威尔两种药之间可能存在差异, 以及目前对Dev.Neu.的研究还在转录情况水平, 缺少表型(phenotype)的共同研究等等… 以及我们在分析过程中发现的患者性别单一, 很多结论的显著性并不明显仅是有统计学意义, 甚至可能存在某些说不清楚的规律结论等等.

总的来说, 作者团队使用了scRNA-seq的方法, 描绘了重症新冠患者的外周免疫反应. 特别是对呼吸衰竭的病人, 作者给出了详细且明显的细胞表型(phenotype)和免疫细胞组成的差异. 这一工作对于进一步理解和认识新冠病毒肺炎, 及可靠的治疗方案提供了新发现, 新思路, 和新资源.

(END)

附录一些喜欢的句式

To elucidate pathways in peripheral immune cells that might lead to immunopathol- ogy or protective immunity in severe COVID-19, we applied single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to profile periph- eral blood mononuclear cells (PBMCs) from seven patients hospitalized for COVID-19, four of whom had acute respira- tory distress syndrome, and six healthy controls

We sequenced 44,721 cells with an average of 3,194 cells per sample . We created a cells-by-genes expression matrix and performed dimensionality reduction by uniform manifold approximation and projection (UMAP) and graph-based clustering, which identified 30 clusters (Fig. 1b,c). We calculated each cluster’s most highly differentially expressed (DE) genes to manually annotate clusters with their respective cellular identities (Fig. 1b,c, Supplementary Table 2 and Methods). Dimensionality (这一部分在介绍scRNA seq的method部分可以直接复制粘贴…)

… , similar to previous reports

did not appear to share particular…

this downregulation was significant in all patients with COVID-19, but potentially more prominent in ventilation-dependent patients

To analyze if there was any transition between the two cell types, we performed a … by … Surprisingly, this analysis demonstrated that …

There are several limitations of our study. (万能结尾甩锅 )