多重DIA-1

1，二甲基标记结合mDIA的可行性探索：BSA 胰蛋白酶消化肽段

探究目标：标记效率；标记精度

2，mDIA用于复杂蛋白质组：HeLa细胞全蛋白组 （胰蛋白酶消化肽段）

2.1 对比label-free，探究二甲基化标记是否影响鉴定深度和精度——未标记肽vs轻标肽。AlphaPeptDeep 预测谱图差异。

添加第二个通道，timsTOF上鉴定几乎保持不变，而在Orbitrap上观察到略微下降。添加第三个通道，Orbitrap的鉴定进一步降低，并且imsTOF略微降低，表明多重谱图的去卷积具有挑战性，并且timsTOF平台的离子迁移率维度对此有帮助。

2.2 计算CV：评估定量可重复性

2.3 将三种不同来源的蛋白质样品——人类细胞（HeLa）、酵母（S. cerevisiae）、以及大肠杆菌（E. coli）——在已知比例下进行测试。这种设计提供了一个定量基准，通过比对测得的蛋白质比值与已知比值，来评估仪器和方法的定量精度。

• MS1 与 MS2 方法的比较：

  • MS1-centric 方法：（？(Appendix Fig S3B)）在 dia-PASEF 扫描周期之间插入多个 MS1 扫描，这与某些 Orbitrap 仪器上的流程类似。
  • MS2-centric 方法：依赖 MS2 数据来进行定量和识别。 MS2-centric 方法在准确性方面略胜一筹。

3，二甲基标记扩展multiplexing的范围

首先，选择了Lys-N而不是Lys-C，需要看化学式理解

与二甲基标记的胰蛋白酶肽相反，三甲基标记并没有显著降低蛋白质组鉴定，CV值直到3重才发生变化，而5重中略有增加。证明了在使用二甲基标记的mDIA实验中multiplexing多达五个样品的可行性。

4，自动，超高灵敏度的mDIA工作流程，带reference channel

• 结合single-cell proteomics workflow ,1 ng 胰蛋白酶HeLa肽的标记效率达到99.5%
• Evosep 仪器中，肽段在极低流速（100 nl/min）的“Whisper zoom”模式下分析。该模式使用了31分钟梯度洗脱，并有7分钟的额外时间用于下一次injection（“40 SPD” 方法）。
• 在如此低的流速下（100 nl/min），避免（post-column）死体积是至关重要的，因为多余死体积会导致信号损失和分辨率降低。为了解决这个问题，Evosep 去掉了传统连接器，并使用了pulled columns，直接装填于电喷雾（electrospray）尖端（IonOpticks ）。这种设计不仅使工作流程更加稳定和可重复，还提高了色谱分离度

5，mDIA使每个单细胞的蛋白质鉴定加倍

6，蛋白质组更稳定，覆盖更深

7，mDIA推进肿瘤学中的单细胞类型分辨空间蛋白质组学

科普知识：

• Lys-C

  • 切割位点：Lys-C 会在 赖氨酸（K）残基的C端（即赖氨酸之后）切割。
  • 生成的肽段末端是游离的羧基COOH。

• Lys-N

  • 切割位点：Lys-N 会在 赖氨酸（K）残基的N端（即赖氨酸之前）切割。
  • 生成的肽段末端是游离的氨基NH3。
• ​​​​​​​Trypsin胰蛋白酶切割在赖氨酸Lys或精氨酸（R）残基之后
• single-cell proteomics workflow (Brunneret al, 2022)：384孔板，用TEAB将裂解和消化缓冲液调整为无胺缓冲液，以实现二甲基标记。在Evotip实现净化和单细胞label，并且合并了不同二甲基标记。

• 后柱死体积：色谱柱（如液相色谱或纳流色谱）与检测器（如质谱仪）之间的管路或接头中存在的无效体积。这部分体积不会参与分离过程，只会造成样品扩散、峰展宽以及信号强度降低，灵敏度降低