生物信息复习笔记（1）——看懂测序

为什么要测序：为了弄清样本中各个基因或者我关注基因的表达情况。

测序流程：

3.将RNA反转成DNA，因为RNA极易分解

5.PCR扩增：以得到足够多的DNA片段用于后续测序。

Flow cell：芯片。上面有很多泳道，样本流过泳道会产生相应化学反应，将DNA片段结合到Flow cell上，以备后续测序使用。

Flow cell表面做了化学修饰，两种不同的寡聚核苷酸引物，通过共价键方式连接到Flow cell上。

引物的作用是与DNA链上的测序接头连接。

共价键是为了保护引物以及连接了DNA的引物不会被冲洗掉。

DNA片段中间灰色部分是提取了RNA之后经过反转录之后形成的一个DNA双链。

两端是测序接头，分为三个部分。分别为 与flow cell结合序列，index，以及 测序结合位点。

测序结合位点：当向测序仪器中加入准备好的DNA片段之后，双链DNA解链为单链，带接头的单链DNA片段遇到Flow cell上与之互补的引物后，与之杂交结合。在聚合酶和DNTP的作用下，开始碱基互补配对，从引物开始向上延申形成互补链。再加入氢氧化钠溶液解开双链，冲洗掉没有和Flow cell引物相连接的原始模板链，仅保留与Flow cell引物相连接的互补链。再加入中性溶液，让DNA发生折叠，折叠后单链的DNA与Flow cell上的另一种引物杂交结合，在DNTP和聚合酶的作用下互补配对，合成一条新的链。再加入氢氧化钠溶液，新的链会解开，然后形成两条互补的DNA单链。反复进行DNA链的折叠，互补配对与解链过程。直到Flow cell上所有引物接头都完成了结合。这个过程叫做桥式PCR。通过化学反应使其中一个引物上的一个基团被切割掉，导致其中一种单链从FLow cell上脱落，并冲洗掉，仅留下另一种单链（拿掉反向链，即与模板链互补的链，留下正向链，和模板链一致）。最后开始测序，加入测序引物和修饰过的DNTP，对剩下的DNA单链进行边配对边测序。

修饰过的DNTP：

叠氮基团用于阻止下一步的配对结合。

荧光基团：ATCG 4种碱基分别带有四种不同颜色的荧光，在碱基配对过程中每新接上一种碱基就会出现一种颜色的荧光。通过激光检测荧光的颜色判断接上去的碱基类型。通过互补配对规则【腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对（在RNA中，A与尿嘧啶U配对），鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对】知道正链上面的碱基类型。

片段中的每个碱基测序完后就会切断这个碱基3‘末端的叠氮基团，让能进行新的碱基的结合，并切掉荧光基团，开始下一个碱基的测序。（一边配对一边测序）

当正链的DNA测序完成后，会洗掉在测序过程中的配对产生的所有反链，然后重复桥式PCR的过程，完成互补链的测序。（双端测序，能够在测序结果中看到两个read）（read1是正链的测序，read2是反链的测序）

为什么要进行双端测序：随着测序的进行，越到后面聚合酶的活性越低，碱基互补配对越容易出问题，越到后面测序结果越不准确。反着来一遍为了提高测序准确度。

测序完成后得到原始数据raw data：

测序评分：测序过程中有些基团的测序可能不准确，有误差。（上图右边是Flow cell上的一小块区域，上面有不同的荧光，当荧光不够亮或者仪器检测灵敏度不够高时，或者同一块区域相同颜色荧光比较多时，检测可信度不高。）

拿到raw data后要去除低质量的read，再将高质量的read注释为相应的基因，同时需计算每个样本中每个基因的read数量，read总数是该样本中该基因的count值。