Nature Biotechnology|利用反向基因组学技术定向分离未培养细菌

圆子糯米酒yu

已于 2023-06-20 09:32:01 修改

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分类专栏：文献阅读文章标签：其他笔记

于 2023-06-09 18:05:02 首次发布

原文链接：https://zhuhaizhen.github.io/

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文章信息

题目：Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics
年份：2019
单位：橡树岭国家实验室，田纳西大学
DOI：10.1038/s41587-019-0260-6
杂志：Nature Biotechnology (IF 36.558)
分类：Research article

1）目的微生物表面抗原的筛选是成功分离的关键，本文提供了三种不同情况的成功案例：
2）对于研究广泛，有同源3D结构的PBP2，结合同源蛋白结构筛选抗原表位
3）对于没有同源3D结构的CpsC，根据结构预测筛选抗原表位
4）针对SR1类群，使用全长的膜外氨基酸作为抗原生产多克隆抗体

方法

样品采集与处理

采集健康人的唾液及牙周炎患者的龈沟液

口腔微生物样品按照1: 5的比例用dental transport medium稀释，涡旋混匀1 min，1,000 g离心2 min去除大颗粒。上清过10 μm细胞筛，12,000 g离心15 min，用1 ml PBS重悬

处理后的样品立即用于活细胞分选

TM7a基因组挖掘，抗原表位筛选及抗体生产

使用当时仅有的两个口腔TM7基因组TM7a和TM7c

根据COG分类，首先属于转运、细胞被膜生成及胞外结构的蛋白

将这些蛋白用TMHMM v.2.0预测跨膜区

选择有跨膜结构域的蛋白，去除注释为hypothetical的及氨基酸数量少于100个的

最终目的是找到相对较大且功能已知的蛋白

选出的117个蛋白与Human Oral Microbiome Database的蛋白质组进行BLASTP比对

48个蛋白与其它物种来源的蛋白相似性大于90%，认为可能是污染

逐个分析剩下的蛋白的跨膜结构域、胞外结构域的数量及大小、同源蛋白是否已报道3D结构及作为抗原的其它实验数据

最佳选择是青霉素结合蛋白PBP2，有高分辨率的晶体结构，且已有文献报道抗-PBP2抗体能够结合在病原微生物的表面，人类口腔微生物中的同源蛋白与TM7a的PBP2相似性为30-40%。为检测没有3D结构及抗原数据的情况下该方法的有效性，也选择了一个CpsC蛋白，属于polysaccharide copolymerases superfamily，人类口腔微生物中的同源蛋白与TM7a的CpsC相似性不超过30%

使用在线服务器预测两个蛋白的抗原区域及多肽的疏水性

ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/cgibin/abcpred)
BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/cite.php)
IEBD Analysis Resource(http://tools.immuneepitope.org/bcell)

从PBP2上找到7个可以作为抗原的多肽，基于大肠杆菌PBP1b的3D结构，用PyMOL分析这些多肽的位置

最终选择了三个暴露在外面的残基最多的多肽之一(SGNIKYAKQRQKTVLTRMV)

从CpsC上找到4个可以作为抗原的多肽，由于没有3D结构，选择了位于胞外结构域的螺旋区的一个肽段(ESAIQEFKEQSKSLYGNS)

商业合成两个最终选出来的抗原多肽，在CpsC的N端和PBP2的C端加一个半胱氨酸，免疫兔子，ELISA验证抗体有效性

HiTrap Protein A HP antibody purification columns纯化IgG，Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit对抗体进行荧光标记

抗-SR1抗体靶点的筛选

使用人类口腔微生物SR1 HOT345的基因组，筛选该类群的抗体靶点

选择了357个氨基酸的假想蛋白BSK20_04595，预测该蛋白有一个跨膜结构域和一个胞外结构域，胞外结构域包含LysM和CHAP结构域

选择氨基酸片段39-357作为抗原，密码子优化，过表达，蛋白纯化，兔免疫，IgG亲和纯化

口腔微生物样品免疫荧光标记及流式分选

悬浮在PBS中的口腔微生物样品，用5%羊血清及IgG混合物(兔抗-Ignicoccus IgG，兔抗-Clostridium IgG，人IgG各1 μg/ml)封闭30 min，封闭一些口腔细菌上潜在的非特异性抗体结合位点

封闭后加入0.1-1 μg/ml荧光标记的抗体，室温孵育1 h，12,000 g离心15 min，用含1%血清的PBS重悬；或者直接用含1%血清的PBS稀释至2 ml

加入到样品中之前，抗体溶液15,000 g离心5 min，小心吸取上清，降低荧光颗粒的背景

30 min后样品进行流式分选

负对照包括未标记的口腔样品(检测自发荧光)及不含微生物的空白处理(检测荧光抗体析出)

如果信号太弱，用二级标记抗体(如羊抗兔IgG)可以放大信号

口腔TM7的分离培养

选用BHI，OTEB，MTGE及TSB培养基，补加多种生长因子

ATCC 维生素，微量元素，澄清过滤的唾液，猪胃粘膜素，糖，氨基酸和核苷酸，N-乙酰胞壁酸，N-乙酰葡糖胺，丙酮酸

96孔板加200 μl培养基，分选后37 ℃培养

培养48-72 h后，用排枪吸取100 μl，过0.2 μm的96孔过滤板。用200 μl PBS冲洗，往滤膜上加20 μl TE，室温100 rpm震荡5 min。吸取10 μl细胞悬液到96孔PCR板中，加10 μl裂解液，95 ℃加热5 min。冰上冷却，加10 μl中和缓冲液。

裂解液：0.13 M KOH，3.3 mM EDTA (pH 8.0)
中和缓冲液：0.13 M HCl，0.42 M Tris (pH 7.0)，0.18 M Tris (pH 8.0)

使用通用引物及TM7特异引物扩增。有条带的培养物进行测序，并转接到新鲜的培养基中

所有检测到TM7的培养物都混杂着很多其它菌

固体培养基选择DMM平板补加2%葡萄糖，0.1 g/l酸水解酪蛋白和10%羊血；BHI平板补加10%羊血

分选获得的单细胞在每个平板上按10 × 10排列，37 ℃培养

培养3-5天后形成的菌落扩增测序

有杂菌的菌落重复划线，直至菌落仅包含TM7及一种宿主放线菌

TM7富集物及宿主共培养物可以在含10%二甲基亚砜的培养基中-80 ℃冻存

结果

基于抗体的口腔TM7细胞分选

通过流式分选，带有荧光标记的细胞占0.1-5%

左图是未标记的样品，RFU > 10^3为自荧光沉淀/矿物质

为检测TM7是否被IgG标记，收集10-100个荧光标记的细胞，进行多重置换基因组扩增(multiple displacement genomic amplification, MDA)，然后用特异性引物进行PCR扩增

MDA是一种单细胞基因组扩增技术，能对全基因组进行高保真的均匀扩增，产生10-100kb的片段，从而放大单个细菌中的DNA至模板所需的微克水平

分选获得的细胞集合中25-100%包含TM7，比例取决于不同样品及分选门参数，抗-PBP2抗体和抗-CpsC抗体都能获得TM7细胞

为增强荧光信号，覆盖尽可能多样的序列，用于培养的实验后续都进行抗-PBP2和抗-CpsC双标记

用MiSeq分析细胞集合中的物种组成，TM7丰度可高达95%，主要是类群1,3,6

基于抗体的TM7培养
固体培养基上获得包含5种不同TM7的菌落

所有TM7阳性的菌落都包含放线菌，80%也包含链球菌，根据文献报道认为放线菌可能是宿主，链球菌由于粘附性强，可能是共分离物

TM7 HOT346和HOT348是不同的物种，但是在同一个Cellulosimicrobium cellulans菌落中检测到

多个TM7可能寄生在同一个寄主细胞上

对Cellulosimicrobium-TM7培养物进行第二轮标记和分选，获得纯的C. cellulans-TM7 HOT346共培养物

在同一个供体的唾液样本中，还获得了TM7 HOT346与Actinomyces sp. HOT171的共培养物，说明在自然环境中，TM7很可能寄生在不同属的细菌中

纯化后的TM7-放线菌共培养物可以在多种标准的富营养培养基中传代，冻存后可复苏

TM7 HOT351属于TM7类群的一个新科或新目，与Actinomyces sp. HOT897共同分离出来

A. odontolyticus XH001是TM7 HOT352和HOT952的宿主

在液体培养基中还检测到TM7 HOT347和HOT870，但是不能在固体培养基上生长，也未能鉴定其宿主

TM7物种及其放线菌宿主之间没有进化距离上的明显相关性

不同TM7可能同时寄生在相同的宿主细胞，相同TM7物种也可以寄生在不同的宿主

分离的所有TM7物种都是直径 < 0.5 μm的球菌，位于宿主细胞的表面

反向基因组学方法分离其它未培养的微生物

使用单细胞基因组数据SR1 HOT345，选择了一个预测的暴露于表面的糖基转移酶，也被注释为参与细胞壁合成的表面抗原

选择整个暴露的~300个氨基酸的结构域用于抗体生产

获得2个SR1培养物，都包含SR1 HOT875，共培养的细菌分别是Fusobacterium periodonticum 和 Parvimonas micra

未能获得足量的菌体进行显微表征

反向基因组学助力单细胞基因组测序

通过对抗体标记的样品进行细胞分选及多重置换基因组扩增，从384组分选获得的细胞中得到二十多个TM7 SAGs (single-cell amplified genomes)，根据16S rRNA序列分为6个物种：HOT346, HOT348, HOT349, HOT351, HOT352, HOT353/952

基因组分箱获得的MAGs通常缺少16S rRNA基因，难以与已知的物种进行系统发育分析，而SAGs不存在这个问题

共测序，组装，分析了23个SAGs，代表人类口腔微生物TM7类群中的6个类群：类群1,2,3,5

将获得的TM7 SAGs与已报道的TM7基因组进行比较基因组学分析，证实了其~0.6-1 Mb的小基因组是基因丢失造成的，这也与其寄生的生活方式相关

并不清楚开放环境中的TM7是否依赖与其它微生物的物理接触

目前所有TM7基因组都缺少电子传递链，但可能存在没有呼吸功能的专性发酵代谢

开放环境中的TM7物种编码近乎完整的磷酸戊糖途径，偶联异型乳酸发酵，从而通过底物水平磷酸化产生NADPH和ATP。人类口腔TM7缺少磷酸戊糖途径中起始NADPH产生的关键酶及异型乳酸发酵的关键酶：磷酸木酮糖磷酸转酮酶。因此，口腔TM7可能利用己糖-戊糖的相互转化并主要通过糖酵解产生ATP