框内缺失法构建S.m敲除株

步骤

1. 基因扩增

hit-up

hit

hit-down

2. 重组质粒构建

双酶切：

hit-up片段、pFW5质粒双酶切，37度6h，酶切产物进行DNA回收纯化，测DNA浓度

T4 DNA ligase连接：

pFW5质粒 + hit-up ——— 连接 ——— 转入DH5a spe100ug/ml ——— 挑单菌落 （#20: pFW5-hit up)

同样方法：将hit-down转入pFW5-hit up质粒，构建hit基因缺陷重组质粒（#141: pFW5-hit up-hit down)

在pFW5 载体的两个多克隆位点区（MCS⁃I 和 MCS⁃II) 前后，设计了pFW5（PCR）两对引物（pFW5⁃F/pFW5⁃ R1 和 pFW5⁃F1/pFW5⁃R），对 20#、141#及对照空质粒 pFW5 进行 PCR 扩增双酶切鉴定，挑选出正确大小的质粒送检测序。测序结果在 NCBI 上进行Blast对比拼接。

3. 变异链球菌hit基因缺陷菌株的构建

选取变异链球菌 ATCC25175 标准株单克隆菌斑接种入 BHI 液体培养基，培养至对数生长中期，

抽取 100 μL 菌液接种至 2 mL BHI 液体培养基，继续培养 2 h，取 300 μL 上述菌液加入 2.4 μL 浓度为1 mg/mL 的感受态刺激肽 CSP 溶液，轻轻混匀，孵 育0.5 h。

将单酶切线性化纯化后的 hit⁃Up⁃pFW5⁃Down质粒 4 μg 加入到上述菌液中，轻轻摇晃培养 3 h 后将菌液涂布于 Spe（+ 0.1 mg/mL）抗性的 BHI 培养板培养 48 h。选取阳性单克隆菌斑，用 CTAB 法提取基因组，送检测序。

4. 变异链球菌hit基因缺陷菌株遗传稳定性

将构建成功的变异链球菌 hit 基因缺陷菌株提高壮观霉素质量分数（1 mg/mL）后多次传代，提取

基因组DNA，再次送检测序

5. 变异链球菌hit基因缺陷菌株生长曲线测定

①甘油菌种经BHI 固体培养基划线活化后，挑选单克隆菌斑接种于BHI液体培养基，厌氧培养约

20 h；取部分种子菌液，用无抗 BHI 培养基稀释到0.5 麦氏比浊浓度，然后稀释 100 倍为工作菌液［（1～2）×106 CFU/mL］。

② 取 96 孔细胞培养板，其中每孔加入 180 μL 无抗 BHI 培养基和 20 μL 工作菌液，厌氧培养，监测其在 48 h 内 OD600 值变化。设置三组平行实验，变异链球菌 ATCC25175

标准株进行生长对照。生长速率计算方法：生长速率=［（OD600）t⁃（OD600）0］/t。