成像引导的深层组织体内声音打印

Elham Davoodi， Jiahong Li， Xiaotian Ma， Alireza Hasani Najafabadi， Jounghyun Yoo， Gengxi Lu， Ehsan Shirzaei Sani， Sunho Lee， Hossein Montazerian， Gwangmook Kim， Jason Williams， Jee Won Yang， Yushun Zeng， Lei S. Li， Zhiyang Jin， Behnam Sadri， Shervin S. Nia， Lihong V. Wang， Tzung K. Hsiai， Paul S. Weiss， Qifa Zhou， Ali Khademhosseini， Di Wu， Mikhail G. Shapiro， Wei Gao

1 Andrew 和 Peggy Cherng 美国加州理工学院工程与应用科学系医学工程系。Terasaki Institute for Biomedical Innovation，美国加利福尼亚州洛杉矶。Alfred E. Mann 美国加利福尼亚州洛杉矶南加州大学生物医学工程系。加州大学生物工程系，洛杉矶，美国加利福尼亚州。加州大学化学与生物化学系，洛杉矶，美国加利福尼亚州洛杉矶。美国加利福尼亚州帕萨迪纳市加州理工学院化学与化学工程系。莱斯大学电气与计算机工程系和生物工程系，美国德克萨斯州休斯顿主街 6100 号。CA 纳米系统研究所，加州大学洛杉矶分校，美国加利福尼亚州洛杉矶。加州大学洛杉矶分校材料科学与工程系，美国加利福尼亚州洛杉矶。*通讯作者。电子邮件： weigao@ caltech.edu

3D 打印为患者特定的植入物和疗法提供了希望，但通常受到侵入性外科手术需求的限制。为了解决这个问题，我们开发了一个成像引导的深层组织体内声音打印 （DISP） 平台。通过将载有交联剂的低温敏感脂质体掺入生物墨水中，DISP 可以使用聚焦超声对各种功能性生物材料进行精确、快速、按需的交联。基于气泡的超声成像提供实时监测，并允许在活体动物中创建自定义模式。我们通过在小鼠膀胱的病变区域附近和体内兔腿肌肉深处成功打印来验证 DISP，证明了其局部药物递送和组织替代的潜力。DISP 打印导电、载药、载细胞和生物粘附性生物材料的能力证明了其在各种生物医学应用中的多功能性。

三维 （3D） 生物打印已成为医学领域的一种变革性工具，能够创建患者特定的植入物 （1， 2）、复杂的医疗设备 （3， 4） 和组织替代物 （5-7）。先进的生物墨水配方和基于挤出或基于光的打印系统 （8， 9） 推动了这一进步，解锁了组织再生 （10， 11）、生物电子学 （12， 13）、药物输送 （14， 15） 和伤口密封 （16， 17） 等不同领域的应用。然而，这些结构的植入通常需要侵入性手术，这限制了它们在微创治疗中的效用 （18， 19）。体内打印技术将能够在体内的缺陷部位直接制造生物结构，无需传统植入，并有助于快速的现场组织修复。尽管近红外 （NIR） 光已被探索为体内打印的生物安全能源，但由于光穿透性有限，其应用仍然局限于皮下组织 （20， 21）。

超声技术以其深层组织渗透性和无创性而闻名，为体内打印提供了一个有前途的平台。其实时成像功能可在生物材料的原位制造过程中实现精确定位和控制 （22）。特别是聚焦超声 （FUS），它允许有针对性的能量传递，促进声空化诱导的材料自由基聚合等过程，包括聚二甲基硅氧烷 （23 24） 或聚乙二醇二丙烯酸酯 （PEGDA） 的声温诱导聚合 （25）（表 S1）。

体内打印的一个主要挑战在于开发多功能生物墨水配方，这些配方能够适应各种生物材料，在各种医疗场景中具有广泛的适用性，同时确保高生物相容性和残留预聚物的最低毒性。全面的体外和体内研究对于解决这些问题至关重要。此外，推进这些技术需要能够进行大规模和高分辨率打印的系统，以及与实时成像的无缝集成，以确保精确的焦点定位，最大限度地减少脱靶组织效应，并加速临床转化。

我们开发了一种成像引导的深层组织体内声音打印 （DISP） 平台，该平台利用低温敏感脂质体 （LTSL） 作为交联剂的载体，以实现深层组织内生物材料的精确和受控原位制造（图 1、A 至 C 和表 S1）。在 DISP 中，LTSL 通过封装交联剂来增强生物相容性，防止与周围组织过早相互作用，并通过 FUS 实现按需释放。LTSL 旨在响应略高于体温的温和温度变化，能够激活各种交联机制，包括离子、氧化和自由基聚合（图 1、D 和 E）。

DISP 可实现高分辨率打印 （~150 μm） 和快速打印速度 （高达 40 mm s）。成功打印了多种功能性生物材料，包括导电、载药、载细胞和生物粘附性水凝胶（图 1，F 到 H）。基于气泡 （GV） 的超声成像 （26， 27） 被集成到打印平台中，允许实时监控打印过程、精确焦点定位和原位交联验证。作为概念验证，我们在活体动物的膀胱和肌肉中展示了体内打印，术后分析证实了预聚物和打印水凝胶的高生物相容性。

深层组织体内声音打印的设计与机制

DISP 利用超声响应性生物墨水（称为 US 墨水），专为精确和受控的原位制造而设计。US 墨水由生物聚合物、交联剂封装的 LTSL 和用作超声成像造影剂的 GV 组成。这些生物墨水通过注射或导管输送到目标部位，并使用集成到 3D 打印平台中的超声成像装置进行定位。该系统准确地将 FUS 焦点对准 US 墨水，并持续监控印刷过程。

FUS 传感器由自动定位系统控制，按照预定义的 G 代码扫描 US 墨水。FUS 诱导的局部加热触发 LTSL 释放交联剂，使 US 墨水能够立即原位交联（图 1、A 和 B）。透射电子显微镜 （TEM） 证实了 LTSL 的完整性（图 1C），而扫描电子显微镜 （SEM） 揭示了均匀的交联和 US 凝胶的形成（图 1D）。DISP 能够合成和精确图案化具有不同特性的功能性 US 凝胶，包括电导率、生物载体能力和生物粘附性（图 1E），扩大了在生物电子学、药物递送、组织再生、伤口密封和其他医疗干预方面的潜在应用（图 1，F 到 H）。

用于受控交联的低温敏感脂质体

低温敏感脂质体广泛用于药物递送，因为它们能够通过设计脂质双层特性来精确控制释放温度。尽管某些脂质体可以使用探针超声仪的低频超声激活，以破坏其膜以进行交联应用 （28），但 LTSL 可以通过 FUS 进行远程和精确激活，从而实现卓越的空间控制。在这项研究中，LTSL 被设计为在 37°C 下保持稳定，并在 ~41.7°C 下快速释放封装材料 （29）。FUS 暴露后，US 墨水内的温度局部升高，这会导致 LTSL 脂质双层从固态变为液态的相变，从而在双层结构中产生纳米孔（图 2A）。

图 1.成像引导的深层组织体内声音打印 （DISP）。（A） DISP 平台示意图。DISP 系统采用由非交联预聚物、负载交联剂的 LTSL 和 GV 组成的 US 油墨。将 US 墨水注射到体内以无创方式在体内制造精确的功能性生物结构。采用基于 GV 的集成超声成像来监测靶器官，检测预聚物的存在，并确保准确靶向和成功形成 US-凝胶。（B） 用于 FUS 生成和监控的体内打印设置。RF，射频;T/R，发射器/接收器。（C） 负载交联剂的 LTSL 的 TEM 图像。比例尺，100 nm。（D） 冻干、3D 打印藻酸盐 US-gel 的 SEM 图像。比例尺，20 μm。（E） 用健全的体内打印打印的功能性水凝胶结构。比例尺，5 毫米（从外到高）基于 DISP 的活体打印，用于传感和记录的生物电子设备 （F）、用于药物输送和组织再生的生物载体 （G） 以及用于伤口密封和设备/组织界面的生物粘合剂 （H）。

图 2.用于交联剂控释的低温敏感脂质体的合成和表征。（A） 示意图LTSL 脂质双层中的纳米孔是由于轻度升高的温度诱导的从固体到液体的相变。（B） 通过挤出工艺大规模生产载有交联剂（例如 Ca）的 LTSL。（C） 挤出前后 LTSL 的 DLS 分析。（D） 使用 fura-2acetoxymethyl ester 作为细胞内钙指示剂对载有 Ca 的 LTSL 进行荧光成像。比例尺，3 μm。（E） 稳定性研究显示，在 4°C 和 25°C 下储存的 LTSL 在 1 个月和 6 个月后会出现 Carelease。（F） 在 43°C 下不同持续时间的 LTSL 的紫外-可见分光光度分析。（G） LTSL 在 43°C 和 37°C 下的温度依赖性释释。 （H） 当 LTSL 浓度固定为 50 wt% 时，藻酸盐 US 墨水在不同加热温度下的交联时间。（I） 具有不同 LTSL 浓度的海藻酸盐 US 油墨的离子交联，通过储存模量 （Gʹ） 和损耗模量 （Gʹʹ） 进行评估。（插图）含有 0、15 和 50% LTSL 的藻酸盐 US 墨水在 43°C 暴露 30 秒后的凝胶状态图像。 比例尺，5 mm。（J） 具有不同 LTSL 浓度的藻酸盐 US 墨水的交联时间测量。（K） 用藻酸盐、含有 50% LTSL 的藻酸盐 US-ink 和藻酸盐 US-gel 培养 7 天的人真皮成纤维细胞的活/死染色图像。比例尺，100 μm。图中的误差线表示与平均值 （n = 3） 的标准差。

发现固相中的晶界缺陷对于脂质双层中稳定纳米孔的形成至关重要。为了增强脂质迁移率并促进孔的形成，形成孔的溶血脂质和一小部分聚乙二醇化脂质被掺入脂质双层中（图 S1）。在加热过程中，这些缺陷会迅速扩大（29， 30），实现受控的有效载荷释放，同时最大限度地减少生理温度下的过早泄漏，确保精确可靠的交联以实现声音印刷。

LTSL 是使用干脂质膜水合工艺合成的，然后进行挤出以实现均匀的尺寸分布（图 2B 和图 S2 和 S3）。动态光散射 （DLS） 分析证实，从多层囊泡成功过渡到单层囊泡，尺寸更小、更均匀（图 2C） （29）。−17.31 mV 的 zeta 电位表明具有高分散性和稳定性（图 S3D）。此外，双光子显微镜验证了藻酸盐基 US 墨水的 LTSL 中成功封装了 CaCl 交联剂（图 2D），而未封装的 CaCland 其他残留物则通过超速离心有效去除（图 S4）。

LTSL 表现出长期稳定性，即使在储存 6 个月后仍保持一致的交联性能（图 2E）。紫外-可见光 （UV-vis） 光谱显示，加热至 43°C 30 秒后，在 650 nm 处有一个明显的 Ca 释放峰（图 2F）。LTSL 在 43°C 时显示出超过 77% 的释放量，在 37°C 时释放量可以忽略不计，确保了 US 油墨的受控按需交联（图 2G）。优化脂质组成、溶血脂质含量脂质体大小可以增强释放曲线，同时平衡渗透性和稳定性以防止过早泄漏，从而在声音印刷过程中实现有效的交联。

通过将离心的 LTSL 重新分配到海藻酸盐溶液中来制备海藻酸盐 US-ink。能量色散 X 射线光谱 （EDS） 证实藻酸盐 US 墨水中存在钙（图 S5）。在固定的 LTSL 浓度下，高温会加速钙的释放并缩短凝胶化时间（图 2H）。流变学研究表明，LTSL 浓度超过 32 重量百分比 （wt%） 时，可快速凝胶化（图 2、I 和 J 以及图 S6A）。然而，在 37°C 下，浓度超过 50 wt% 会导致 1 小时内出现不良的自缔合（图 S6、B 和 C）。因此，选择 50 wt% 作为藻酸盐 US 墨水的最佳浓度，实现按需原位藻酸盐交联（图 S6D），并解决了传统基于离子扩散的交联的局限性，这对于体内应用来说是不切实际的。

生物相容性对于生物医学应用中的预聚物和打印结构都至关重要。对人真皮成纤维细胞进行的活/死活力测定证实，培养 7 天后细胞活力高且形态正常（图 2K 和图 S7）。

US-ink 设计策略用途广泛，不仅支持离子交联，还支持自由基聚合。作为概念验证，基于 PEDDA 的 US 墨水是使用负载四甲基乙二胺 （TEMED） 的 LTSL 开发的，并以类似的方式合成和纯化（图 S8A）。在 43°C 下，LTSL 的 TEMED 释放在 30 秒内迅速发生（图 S8、B 和 C）。将这些 LTSL 掺入含有 PEGDA 单体和过硫酸铵引发剂的预聚物混合物中（图 S9A）。在 12% TEMED LTSL 浓度下，在 43°C 下实现了最短的交联时间，在 37°C 下 1 小时后未观察到凝胶化（图 S9，B 至 E）。重要的是，由于快速局部加热，体内打印期间的 FUS 暴露进一步缩短了交联时间，优于传统的流变学设置。

FUS 诱导的高分辨率 3D 打印

FUS 波精确会聚在一个焦点上（图 3A）并有效地深入组织，达到几厘米或更深的深度，远远超过其他能量传递方法，如紫外光、可见光或近红外光，这些方法由于吸收和散射而被限制在几毫米（图 3B）。在 DISP 平台中，FUS 支持具有亚毫米焦区的高分辨率活体打印。

FUS 暴露通过声能吸收在焦点处产生局部温度升高 （31）。焦点的热特性表明，加热区的大小取决于曝光时间和频率（图 3C），传感器功率的增加会提高焦点的压力和温度（Fig. 3D 和图 S10、A 和 B）（32）。压力区测量（图 3，E 和 F）与仿真结果（图 3、G 和 H 以及图 S10、C 和 D）非常一致，证实了聚焦区尺寸与换能器频率相关。仿真进一步表明，扩大传感器孔径会减小焦点区域的大小，从而提高精度（图 S11）。

在 US 墨水中，超声吸收诱导的局部加热和温度梯度会触发 LTSL 相变并引发交联（图 S12）。在多次 FUS 暴露中，温度变化保持一致（图 S13）。通过在 8.75 MHz 下调整打印参数（如功率和速度）来优化 DISP 打印的 US 凝胶图案（图 3，I 到 K，图 S14 到 S16 和视频 S1），达到 150 μm 的分辨率。具有较小焦区和更高打印速度的高频 FUS 可以进一步提高分辨率。在较深的 7 毫米 US 墨水盒中对独立打印进行线宽和线高表征（图 S17）。在此过程中通过改变打印功率和速度来产生渐变大小的图案（图 S14E）。

通过在 ~15 和 ~40 mm 厚的猪肉和鸡组织下以各种分辨率打印藻酸盐 US 凝胶，进一步证明了 DISP 的能力（图 3L 和图 S18）。此外，可以使用螯合物乙二胺四乙酸 （EDTA） 选择性地去交联并从组织中去除打印的藻酸盐 US-凝胶 （33）（图 3M 和图 S19）。

图 3.聚焦超声诱导 3D 打印的表征。（A） FUS 波传播示意图，说明了 US 墨水的精确目标。（B） 超声波的组织穿透深度与各种光源的比较，突出了超声的卓越穿透性。UVA，紫外线 A;UVB，紫外线 B;NIR，近红外。请注意超声波频率与穿透深度之间的反比关系。（C） 热模拟显示了不同频率和曝光时间下焦点处的温度分布。比例尺，2 毫米。（D） 超声暴露 10 秒期间和之后 8.75 MHz FUS 焦点的温度曲线。（E 到 H）使用 2.65 MHz 传感器在焦点处绘制归一化压力图，在 X-Z 平面 （E） 和 X-Y 平面 （F） 中使用水听器进行实验测量，在 X-Z 平面 （G） 和 X-Y 平面 （H） 中模拟结果。（I） DISP 印刷的 US 凝胶模型。插图比例尺，400 μm。右侧图案的比例尺，4 毫米。（J） 海藻酸盐 US 墨水使用 8.75 MHz 传感器在不同功率水平和打印速度下的适印性。（K） 使用 8.75 MHz 传感器在不同功率水平和打印速度下对藻酸盐 US-ink 的线宽进行打印分辨率。比例尺，5 毫米。（L） 海藻酸盐 US 墨水的打印分辨率，以线宽测量，在 15 毫米厚的猪里脊肉组织下以 18 W 的功率打印时，频率和打印速度各不相同。（插图）猪组织上的深层组织印刷图案。比例尺，5 mm。（M） 使用 DISP 在组织上图案化的藻酸盐 US-凝胶的解离，通过用 0.025 M EDTA 溶液处理 5 分钟来实现。图中的误差线表示与平均值 （n = 3） 的标准差。

功能性生物材料打印

DISP 技术为打印各种功能性生物材料提供了一个多功能平台，解锁了生物电子学、药物输送、组织工程、伤口密封等领域的应用（表 S2 和 S3）。通过精确控制材料特性和空间分辨率，DISP 非常适合直接在活组织内创建功能结构和图案。

使用 DISP，我们成功地使用含有碳纳米管 （CNT）、Ag 纳米线 （AgNW） 和 MXene 薄片等导电添加剂的海藻酸盐 US 墨水打印了水凝胶生物电子学（图 4A）。DISP 的无喷嘴方法避免了在使用高添加剂浓度油墨时传统印刷方法中常见的堵塞问题。通过优化打印参数（如速度、功率和 CNT 浓度），实现了具有可调电阻和图案的定制水凝胶电路（图 S20）。校准曲线表明电阻和线宽之间存在反比关系，与理论预测一致（图 S20C）。通过增强 CNT 网络内的电子转移，带有 CNT 的导电 US 墨水将藻酸盐的欧姆电导率和离子电导率显著提高了近一个数量级（图 S21）。尽管 CNT 添加剂增加了粘度，但油墨的剪切稀化特性允许有效注射（图 S22A）。与含有其他导电添加剂的美国油墨相比，基于 CNT 的油墨的凝胶化时间也更短（图 S22，B 到 D），并且由于吸声性更高，印刷线条比非导电油墨略宽（图 S22E）。这些导电超声凝胶在拉伸和压缩载荷下保持稳定的导电性，使其成为可穿戴和植入式生物电子学的理想选择（图 4B 和图 S20，D 至 F）。此外，结合 CNT 和 AgNW 的混合油墨实现了 10 倍的电导率提高。SEM 证实了 US 凝胶内 CNT 纤维的结构完整性和缠结（图 S23）。生物相容性研究表明，导电 US-ink 和 US-gels 没有明显的细胞毒性（图 S24）。 DISP 打印的水凝胶生物电子学在个性化健康监测方面显示出有前途的应用，包括在生理相关温度范围内具有高灵敏度的电阻式皮肤温度传感器（图 4C）和用于可靠监测生理生命体征的生物电势电极，例如心电图 （ECG） 和肌电图 （EMG）（图 4D）。

DISP 打印的 US-凝胶也可以用作生物载体能够封装各种小分子和大分子，从而能够在所需位置对治疗药物进行靶向体内打印，以实现持续和局部的药物递送（图 4、E 和 F，以及图 S25 至 S27）。使用 3D 肿瘤微球的体外研究表明，与游离给药相比，暴露于载有阿霉素 （Dox） 的 US 凝胶后细胞死亡明显增加。即使在多次更换培养基后，这种增强的治疗效果仍持续 3 天，模拟了更真实的体内条件（图 S28）。

DISP 通过将载有细胞的水凝胶在体内直接打印到受影响的区域来实现微创组织再生。在低超声振幅下打印载有细胞的藻酸盐 US-gel 的图案，确保细胞的安全温度条件（图 S29）。打印的细胞在打印后 7 天内表现出高活力 （图 4、G 至 I 和图 S30A），对形态或功能没有实质性的细胞毒作用。此外，将细胞掺入 US 墨水中并没有显着改变预聚物的流变特性（图 S30B）。为了评估 US 凝胶的稳定性，评估了它在细胞培养基中的溶胀和降解（图 S30C）。这一进步为体内深处的微创组织再生开辟了新的可能性。

生物粘合剂的体内打印提供了一种无创方法来密封组织破裂和撕裂伤，从而能够在各种形状的伤口上按需形成生物粘附图案。为了实现这一目标，我们开发了一种儿茶酚修饰的明胶咖啡酸偶联物 （GelCA） （34） 的预聚物溶液，其中高碘酸钠 （NaIO） 封装在 LTSL 中以形成 GelCA US 墨水。FUS 暴露后，NaIO 被释放，触发交联并形成组织粘附水凝胶（图 4J 和图 S31A）。在 43°C 下微热后 30 秒内，NaIO 从 LTSL 中释放出来（图 S32），产生具有更高生物粘附强度的 GelCA US-凝胶（图 4、K 和 L）。20% 的最佳 NaIO LTSL 浓度可确保在 37°C 下 1 小时后有效交联而不会过早凝胶化（图 S31）。

此外，当使用更高的 US 振幅和更长的曝光时间进行印刷时，典型的非粘附性藻酸盐 US 油墨具有粘合性能，这与关于 US 诱导粘附的文献报告一致 （35）。超声有助于预聚物整合到组织中，然后进行原位交联，从而增强组织内海藻酸盐 US 凝胶的机械互锁（图 4、M 和 N）。

活体动物中 DISP 打印的体内评价

使用小鼠模型进行体内实验（图 5A 和图 S33）。预聚物体内注射过程中所承受的剪切力不会对 US 墨水的流变特性产生重大影响（图 S34A）。此外，在 4°C 下储存的藻酸盐 US 墨水具有至少 450 天的长保质期，增强了其对 DISP 应用的适用性（图 S34B）。作为概念验证，DISP 技术用于在小鼠膀胱中打印 US 凝胶，目的是开发治疗严重膀胱癌的潜在平台。

超声成像在精确定位深层组织内的预聚物方面起着关键作用，这对于组织再生和药物输送等有效的体内应用至关重要。通过对 FUS 传感器相对于成像传感器进行细致的校准，实现准确的定位，最大限度地降低脱靶效应的风险，并防止健康组织意外暴露。此外，将刺激响应 GV 造影剂和 GV Casensors 与 US-ink 集成可在打印过程中提供实时反馈 （26， 36）。这种集成可确认 US 凝胶的形成，监测打印形状并跟踪交联动力学。与用于焦点温度评估的磁共振成像引导技术相比，GVs 提供了打印的 US 凝胶的直接可视化 （37， 38）。将刺激响应 GV 造影剂与预聚物相结合，可实现高对比度，从而可以使用振幅调制 （AM） 模式超声成像轻松可视化 US 墨水 （27）。GV 的加入不仅有助于将生物墨水准确地输送到膀胱，而且还能够确认凝胶的形成在 FUS 暴露时，因为 GV 的崩溃表明成功靶向（图 5、B 和 C）。这种能力可以直接在器官的病变区域进行精确打印，并且 US 墨水中存在 GV 对打印分辨率的影响可以忽略不计（图 S33E）。

图 4.基于深层组织体内声音打印的功能性生物材料 3D 打印，用于各种医疗应用。（A） 导电 US 墨水的原理图。缠结在藻酸盐 US 墨水中的 CNT 添加剂，使用 FUS 交联。（B） 导电 US-gel 图案在循环弯曲变形下保持稳定的电性能。（C） 使用印刷导电 US 凝胶进行温度传感。（插图）与人体皮肤接触时，温度传感器响应一致且可逆。RT，室温。（D） 用于人类参与者心电图和肌电图记录的 DISP 打印导电 US-gel 传感器。（E） 将治疗性生物分子整合到 US-ink 中，形成生物载体 US-凝胶，用于潜在的药物递送应用。（F） 从 US 凝胶中连续可持续释放模型药物罗丹明 B。（G） 通过将细胞整合到生物相容性 US 墨水中，然后使用 8.75 MHz 换能器以 7 W 和最小 10 mm 的打印速度打印来制备细胞封装的 US 凝胶。（H） 打印后第 1 天和第 3 天封装在藻酸盐 US 凝胶中的 C2C12 小鼠成肌细胞的活/死染色图像。比例尺，100 μm。（I） 打印后第 1 天至第 7 天评估的细胞代谢活性。（插图）用 8.75 MHz 传感器以 7 W 和 10 mm min 打印的充满细胞的 US-gel 图案的图像，显示打印后 3 天的活细胞。比例尺，200 μm。（J） 儿茶酚修饰的明胶-咖啡酸偶联物 （GelCA） US 墨水与 NaIOliposomes 混合，用于生物粘附应用。（K） 交联前后 GelCA US-ink 的粘合强度。（插图）轻度加热和交联前后的 GelCA US-ink 图像。（L） 用于密封穿刺心脏组织的 GelCA US-gel 的离体粘附试验。比例尺，5 毫米。（M） 体内 US 诱导的粘附，其中 FUS 促进预聚物喷射到组织，然后海藻酸盐 US-墨水的原位交联以实现机械联锁。 （N） 皮内注射 US 墨水并使用 2.65 MHz 换能器以 7 W 的功率进行交联后，以 20 mm 小黄粒活体动物的打印速度在体内打印的藻酸盐 US-凝胶。在藻酸盐 US 凝胶和组织之间观察到很强的界面粘附力，并使用蓝色染料以提高可见度。比例尺，6 毫米。图中的误差线表示与平均值 （n = 3） 的标准差。

进一步探索了 DISP 用于局部药物递送，其中在肿瘤部位附近打印载药的 US-gel。在动物处于麻醉状态时，采用超声成像监测打印过程使用 B 型超声成像监测导管的位置，以确保在将 US 墨水注入膀胱之前成功滴注（图 S35A）。然后将 FUS 应用于靶向肿瘤附近的 US-ink，导致一些 GV 崩溃，证实了有效的靶向。从处死动物的腹部观察到透明的 US-gel，证实体内打印成功（图 5D 和图 S35）。

为了进一步评估 Carelease 区并确定原位打印的 US 凝胶的大小和形状，采用了 GV Casensors进入 US-ink （39）。这些传感器在 AM 模式成像期间保持非活动状态，但在 FUS 诱导的 Carelease 时被激活，产生明显的对比度（图 5E 和图 S36）。在较高的超声振幅下，一些 GV Ca 传感器塌陷在打印结构的中心，在那里施加了最大压力，而打印的 US-gel 的边界仍然清晰可辨。

图 5.成像引导的体内深层组织声音打印。（A） 在活体动物体内进行声音打印的设置，采用超声成像进行精确定位。（插图）在小鼠体内打印的线性图案。比例尺，4 毫米。（B 和 C） 使用 GV 造影剂的 AM 模式超声成像示意图，用于监测体内 US-ink 分布 （B） 并确保精确定位 （C）。（C） 中的超声图像插图：在横截面中打印和成像的一行 GV 集成藻酸盐 US 墨水。未暴露于 FUS 的区域的 GVs 保持完整，而暴露于 FUS 的区域的 GVs 则塌陷。（D） 麻醉小鼠膀胱肿瘤部位的 US-gel 体内打印。GV collapse 确认成功定位。打印后，提取小鼠膀胱以验证打印成功。比例尺，4 毫米。（E） 使用集成到藻酸盐 US 墨水中的 GV Ca 传感器进行原位传感，设计用于在暴露于 Ca 时激活。使用 AM 模式超声成像打印一条线并在横截面上成像。印刷线中心的较高压力导致 GV Casensors 部分塌陷，而印刷 US-gel 边界的 GV Casensors 被激活，确认了形状。（F） 在兔子模型中，使用 2.65MHz FUS 在 11 W 和 15 mm minon 腹部肌肉上打印的 US-gel 线。比例尺，5 毫米。（G） 使用 2.65 MHz FUS 以 20 W 和 10 mm 最小的速度将 US 凝胶线打印到内收肌深处和股二头肌下方。比例尺，5 毫米。（H） 在小鼠中皮内注射 US 墨水和超声打印 US-凝胶的体内生物相容性研究，通过打印后 1 周和 4 周皮肤组织的苏木精和伊红 （H&E） 染色进行评估。比例尺，200 μm。

为了在更大的动物模型中进行演示，在兔子身上进行了离体和体内实验（图 5、F 和 G、图 S37 和 S38 以及电影 S2）。在暴露的腹部肌肉、内收肌深处和股二头肌下方实现了成功的体内打印，突出了针对更深组织层进行组织置换等应用的能力。

实用的体内打印面临着组织异质性和影响超声吸收和交联的动态环境等挑战。在麻醉下的实验中观察到组织运动的干扰最小，但在肺或心脏等动态器官上打印仍然具有挑战性。GV Ca 传感器与 AM 超声成像相结合，可以实时监控和调整打印参数以应对这些挑战。未来的进步，例如基于机器学习的自适应换能器定位，可以进一步提高心脏打印等复杂场景的精度。

通过苏木精和伊红 （H&E） 和免疫荧光染色进行的体内生物相容性分析得到证实US-ink 和所得 US-凝胶的生物相容性（图 5H 和图 S39）。H&E 染色显示无组织损伤或异常免疫细胞浸润，而免疫荧光染色显示轻微的促炎活性和巨噬细胞浸润。CD80 标志物显示促炎活性没有显着增加，F4/80 标志物表明巨噬细胞分布与正常的生理重塑一致，没有过度或聚集的免疫反应。未观察到毒性迹象，来自其他器官的组织没有显示出明显的变化（图 S40）。在仅接受 US-ink 注射的组中，US-ink 在 7 天内被身体完全清除。然而，在暴露于 FUS 的组中，US-gel 持续存在（图 S41）。

结论

使用载有交联剂的 LTSL 进行超声引导的体内声音打印，可在体内深处精确、高速、高分辨率地制造功能性生物结构。利用不同的交联化学方法设计了各种生物墨水，包括导电、载药、载细胞和生物粘附配方。实时超声成像确保精确定位并受控原位交联。体外和体内研究都证实了预聚物和印刷水凝胶的高生物相容性。作为概念验证，体内打印在小鼠膀胱和兔腿肌肉中成功证明，展示了其在靶向治疗干预和组织替代方面的潜力。

参考文献及注意事项

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