抗体纯化策略——介质篇

导读：自从抗体被发现以来，有多种方法可用于分离纯化抗体，科学家们一直在探索单抗分离纯化方法，以及适于抗体药品规模生产的工艺。

制备高特异性、效价高的抗体是实验免疫学技术基础，未纯化或纯化不好的抗体，不仅会干扰实验的正常进行，而且还可能产生与实验预期相悖的结论，抗体试剂质量的高低将直接影响实验数据准确性、稳定性关系着实验的成败。

为了获得成分相对单一的抗体或将抗体用于特定的用途，就需要进行抗体纯化，这样一方面可以显著减少非特异性本底，去除易引起实验误差的污染蛋白或杂质；另一方面，也能控制实验中产生阳性信号的抗体量及提升检测试剂的灵敏度及准确性。在多种不同的技术中,亲和层析是纯化抗体最具选择性、快速和容易的纯化方法。对于IgG的纯化，通常情况下，我们都会选择使用Protein A或Protein G进行亲和层析。

提到Protein A和Protein G，相信大家并不陌生，由于它们和抗体的特异性亲和作用，可用于纯化抗体，免疫共沉淀实验等，其应用非常广泛。为了更好的区分与选择Protein A和G，小编在此，将对这两类填料的“来世今生”一一进行介绍。

Protein A层析：

天然的Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42kD，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区，而与Fab区结合很弱，具有5个IgG结合结构域(A,B,C,D,E,见下图)和未知功能的非Fc结合域（X,见下图），此结构的蛋白A在大量结合IgG的同时，由于其非Fc结合域结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够。天然的Protein A结构示意图如下：

                       图1：天然的Protein A结构示意图

对此，科学家利用基因工程的方法对Protein A基因进行改造，将蛋白A的Fc结合结构域（即IgG结合结构域）进行保留，对其非Fc结合域截短，分子量变小为35kD，其非特异性结合降低，也消除了对Fab段的亲和作用。同时末端经过改造后加上一个C端的半胱氨酸，利用环氧活化的方式单点偶联到琼脂糖上，在降低空间位阻的同时也提高IgG的结合能力。

但是无论天然蛋白A还是重组蛋白A依然存在对NaOH高度敏感，在强碱性条件下易变性或脱落，因此运用时只能选用高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，但清洗的效果远远不如NaOH，导致清洗成本高。后经研究发现，在重组蛋白A的5个结合结构域中，B位点的结合IgG能力强，通过将B位点对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸，其耐碱性大大提高，然后对该区段进行复制，得到新的四聚体配基SuRe Ligand，其载量更高，避免了Protein A中不同IgG结合结构域与抗体Fc段亲和性的差异，使得洗脱条件更加均一而温和。相比以rProtein A 为配基的介质，Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，可有效避免抗体在低pH下的聚集，纯化的产品纯度和均一性更高，浊度也更低。

                   图2：天然蛋白A、重组蛋白A及SuRe的基因改造位点及相互关系图

近年来，Cytiva又重磅推出的全新概念纤维基质亲和层析产品HiTrap Fibro PrismA 和 HiScreen Fibro PrismA。此系列产品颠覆了传统琼脂糖骨架的纯化模式，利用了纤维束高流速和高通量的特点，通过Fibro 全新基架+PrismA 配基强强联合，极大缩短了蛋白的保留时间，使得一次抗体纯化在5分钟内轻松搞定。在具有高载量高通量的同时，此层析介质能够耐受 2M NaOH，确保能够实现更有效的清洁和灭菌。可将整个工艺生产周期缩短在一天之内完成。生产能力相较于传统填料能提高 20 倍以上。

综上所述，由于Protein A耐碱形式的突变体，具有高选择性和稳定性，脱落更少。因此，在实验室和工业生产工艺中，大家都会选择protein A亲和层析作为抗体纯化的一个标准步骤。作为层析纯化的第一步，从澄清的细胞培养上清液中捕获抗体，通过此步，IgG样品纯度一次纯化可超过90%，并且适用于所有人源的(非IgG3)抗体和Fc融合蛋白的纯化。

Protein G层析：

Protein G是从G类链球菌（Streptococci）中分离出来的胞壁蛋白，分子量25kDa，相对于Protein A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力。

由于天然Protein G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、α2-巨球蛋白相结合,这使得用天然Protein G亲和色谱提纯抗体时,无法去除体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前这一问题已经通过基因修饰的方法表达Protein G得以解决，重组蛋白G已经去除了白蛋白结合位点（血清白蛋白是抗体来源的主要污染物）及细胞表面结合位点，减少了非特异性结合。

对于抗体的Fc段，Protein G与Protein A均可结合，不同的是Protein G还能结合Fab段，因此，Protein G可以结合更多类型的IgG分子及多克隆IgG分子，尤其是对人IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。因此，Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG。但由于protein G的填料要比protein A的贵不少，且载量比较低，洗脱的时候protein G的pH要比protein A更低一些，因此，目前多数情况下只是作为Protein A备选填料使用。

              图3：Protein G与Protein A结合位点的简单图示

北京同立海源生物科技有限公司，真核表达GMP级免疫治疗上游原料生产企业。抗人单克隆抗体产品线，真核表达翻译后修饰与天然抗体类似性高、活性强、效果好、稳定性高。同时，我司可按需要对抗体的相关基因进行突变或重组改造。

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