蛋白质中二硫键特征的质谱分析技术及其应用

蛋白质中二硫键特征的质谱分析技术及其应用

摘要
二硫键是蛋白质的重要结构部分：它们确保正确的折叠，提供稳定性，并确保正确的功能。随着越来越多的蛋白质用于生物治疗，特别是高度二硫键结合的单克隆抗体，现在确认正确的二硫键连接性和验证蛋白质治疗中是否存在二硫键变体非常重要。这些研究有助于确保安全性和有效性。因此，二硫键是蛋白质的重要质量属性之一，在生物治疗的发展过程中必须密切监测。然而，由于生物分子的复杂性，二硫键分析具有挑战性。质谱（MS）已经成为表征这些复杂生物分子的主要分析工具，并且已经报道了几种方法来满足绘制蛋白质中二硫键的挑战性任务。在这篇综述中，我们描述了相关的，最近基于质谱的技术，并提供了有效的蛋白质二硫键分析所需的重要考虑因素。综述了合适的样品制备方法、二硫键分析的裂解技术、基于裂解技术的最新二硫键图谱绘制方法，以及从液相色谱-质谱/质谱数据中快速分析二硫键的自动算法。参与蛋白质表征方法开发的研究人员可以使用本文中的信息来促进基于质谱的蛋白质二硫键分析新方法的开发。此外，生物治疗的个体特征，特别是抗体中二硫键的定位，可以利用这篇综述来选择生物产品二硫键分配的最佳策略。
介绍

蛋白质中二硫键的形成及其重要性

二硫键是在细胞内蛋白质生物合成过程中，在两个半胱氨酸（Cys）树脂的硫原子之间形成的蛋白质的翻译后修饰。共价键的形成是由Cys残基的游离巯基（SH）侧链的氧化引起的，主要由酶催化，包括蛋白质二硫键异构酶和内质网氧化还原素1[1，2]。大量蛋白质含有二硫键。根据已知的817个含有4594个二硫键的血浆蛋白质的三级结构，Butera等人[3]估计蛋白质与二硫键的比例为1:5。因此，Farrah等人[4]鉴定的大约2000个血浆蛋白质将包含大约10000个二硫键，仅血浆蛋白质中就有大量的二硫键。二硫键在蛋白质折叠过程中起着重要的作用，在蛋白质中起着结构和功能双重作用。
在结构上，二硫键确保蛋白质的正确折叠；它们可以导致结构异构体[5]，并稳定蛋白质的天然高阶构象，这些构象是执行其生物功能所必需的[6，7]。因此，二硫键工程的概念在生物技术中是一个有吸引力的选择，因为非天然二硫键可以被工程到蛋白质中以增加蛋白质的稳定性。就目前而言，一些最初缺乏二硫键的蛋白质在工程二硫键的作用下更为稳定[8,9]，而具有天然二硫键的蛋白质的稳定性随着额外二硫键的引入而增加[10–13]。在某些情况下，工程二硫键增加了蛋白质的半衰期[8，14]，减少了自聚集[15]，降低了免疫原性[16]。除了蛋白质，含有工程二硫键的肽也显示出增加的稳定性和半衰期[17，18]。尽管这些试验证明了蛋白质和肽中额外的二硫键的好处，但并非所有的工程二硫键都能提高蛋白质的稳定性[19]。
一些二硫键，称为变构二硫键，负责蛋白质的有效生物功能，这种键的断裂会导致蛋白质活性的变化[20]。Butera等人[3]和Hogg[21]对变构二硫键在血液和癌细胞中的功能作用进行了广泛的综述。最近的一份报告显示，利妥昔单抗和曲妥珠单抗（以IgG1为基础的药物）中某些二硫键的还原和烷基化增加了修饰药物与某些Fcγ受体同种型的结合亲和力[22，23]，但也导致与其他Fcγ受体的结合力降低[23]。在某些情况下，参与二硫键的Cys残基突变可能对蛋白质的生物活性没有影响，例如抗CD44 IgG2抗体的情况，Cys对丝氨酸的突变导致结构改变，但对蛋白质与受体和补体C1的结合没有影响[24]。然而，并非所有的IgG2抗体都是如此。
因此，蛋白质中二硫键连接模式的定位为蛋白质稳定性、结构-功能关系以及任何二硫键介导的蛋白质亚型的研究提供了重要信息。此外，二硫键的表征在生物制药的发展过程中具有重要的意义，以确保生物制剂的安全性和有效性，近年来生物制剂在医药市场上的应用急剧增加。因此，对蛋白质，特别是治疗蛋白质中二硫键的精确表征的有效分析方法的需求日益增加。

生物治疗中的二硫键

蛋白质二硫键特性在生物制药工业中变得更加重要，因为越来越多的重组蛋白被用作治疗癌症、关节炎、哮喘和糖尿病等疾病的生物疗法（生物制剂）[25，26]，以及各种疾病的疫苗[27，28]。这些生物制剂来自大量的蛋白质类，包括激素[25,29]、单克隆抗体[25,26,30]和生长因子[31,32]。所有这些生物分子都含有二硫键合的蛋白质。在这些蛋白质中，高度二硫键结合的IgG抗体（IgG1和IgG4有16个二硫键，IgG2有18个二硫键，IgG3有25个二硫键）[33]，以及以IgG为基础的疗法是市场上最流行的。因此，二硫键是抗体药物的许多关键质量属性之一，必须在其整个开发阶段进行监测，因为二硫键的减少和混乱可能发生在生物治疗药物的制造[34，35]和储存[36，37]。图1显示了四大类IgG的二硫键模式。据报道，在制造过程中存在游离二硫键（还原二硫键），它们可导致非天然二硫键和聚集体的形成[38，39]，并可能导致生物疗法的免疫原性和生物活性丧失。因此，在生物发展过程中，有必要对二硫键进行表征，以确认二硫键的正确连接，并验证是否存在二硫键变体，从而确保药物的安全性和有效性。此外，监管机构要求全面描述生物分子中的二硫键模式，以满足生物制剂的质量设计要求[40，41]，因此需要有效的方法来绘制生物治疗中的二硫键。

二硫键特性的分析方法

已经开发了几种蛋白质中二硫键分析的方法，这些方法使用多种分析技术，包括核磁共振波谱[42–44]、X射线晶体学[45]、埃德曼降解[5,46]、对角纸电泳[47,48]和液相色谱（LC）与质谱联用（MS）[49–51]，这是本文的重点。核磁共振波谱和X射线晶体学在分子水平上提供了有关二硫键的信息，但它们需要大量高纯度的样品，并且由于这些方法求解结构的吞吐量较低，因此通常不用于二硫键作图。传统的方法，如Edman降解法和对角线纸电泳法，是20世纪60年代早期二硫键定位的主要方法，尽管Edman降解法（结合MS）在本世纪第一个年代末仍然很少使用[5,46]。随着质谱技术的出现，液相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法已成为蛋白质二硫键定位的常用方法。
自底向上质谱是蛋白质二硫键分析中应用最广泛的方法。自下而上方法的吸引人的方面包括各种酶的可用性，以将大的生物分子消化成更容易分析的小块（含有完整二硫键的肽），几种软电离技术，互补裂解技术，以及将质谱计与质谱计耦合的能力质谱分析前酶解物分离的液相色谱系统。使用MS进行二硫键分析的关键挑战包括：具有高Cys含量和复杂二硫键连接性的蛋白质，防止样品制备过程中二硫键干扰，测定低水平的非天然二硫键，二硫键介导的蛋白质异构体的定量，以及选择适当的方法（或裂解技术）来分配蛋白质中的二硫键，特别是含有复杂二硫键模式的蛋白质。许多二硫键分析方法已经被开发出来，部分是为了应对这些挑战。

图1显示四类IgG抗体的典型二硫键（DSB）模式的结构。黑色和红色部分分别表示常量（C）和变量（V）区域。H代表重链，L代表轻链。VL和CL是轻链上的结构域，VH、CH1、铰链、CH2和CH3是重链上的结构域。IgG3在铰链区有一个重复三次的15个残基片段；每个片段包含三个DSB

在下面的章节中，我们回顾了最近用于二硫键分析的自底向上质谱方法，并为所涉及的步骤提供了重要的考虑因素。许多关于二硫键分析的评论，包括2007年之前开发的附加方法，已经发表[49–51]。在此，我们首先深入研究样品制备，这是成功绘制蛋白质中天然和替代二硫键的关键步骤。我们提供了几个重要的提示，以防止在样品制备过程中引入二硫键伪影（或干扰）。最后，我们讨论了二硫键连接肽在各种质谱解离技术作用下的裂解特性，这些技术对二硫键定位非常重要，并描述了最近十年发展起来的基于质谱的二硫键表征方法。

用于自底向上质谱二硫键分析的样品制备

样品制备方法概述

样品制备是自底向上质谱分析二硫键的关键步骤。一般来说，分析通常以两种方式之一进行：非还原（完整）分析或还原/完整分析。非还原法是最常用的方法，其样品制备工作流程如图2所示。这种方法需要任何游离Cys残基的烷基化、去糖基化（对于糖蛋白，仅在必要时；参见样品制备）-
糖蛋白定量（更多细节），蛋白水解研究-
在不减少二硫键的情况下对蛋白质进行修饰，并研究二