自上而下的显著性检测有哪些_2020版中国药典四部液相色谱法究竟都做了哪些修订...-CSDN博客

2020版药典修订工作正在如火如荼进行中，那你知道液相色谱法新增和修订了哪些内容吗？与2015版药典有哪些不同吗？在这里就把修订的内容进行总结归纳。

《中国药典》2020年版四部通则发布了高效液相色谱的的增修内容，具体情况如下：

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9～4.6mm，填充剂粒径为 3～10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径(约 2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 1、色谱柱反相色谱柱 以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。 正相色谱柱： 用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱： 用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱： 用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过 60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。烷基硅烷带有立体侧链保护、或残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛 pH 值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 2、检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、电喷雾检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器、电喷雾检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系;，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。; 电喷雾检测器的响应值与被测物质的量通常也呈指数关系，一般需经对数转换或用二次函数计算，但在小质量范围内可基本呈线性。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法(通则 0401)项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器、电喷雾检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐成分的流动相。 3、流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般应不低于 5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。流动相注入液相色谱仪的方式(又称洗脱方式)可分为两种：一种是等度洗脱，另一种是梯度洗脱；用梯度洗脱分离时，通常以表格的形式在品种项下规定，其中包括运行时间和流动相在不同时间的成分比例。品种正文项下规定的条件，除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当调整。若需使用小粒径(约 2μm)填充剂以提高分离度或缩短分析时间，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配，如有必要时，色谱条件(参数)可适当调整。调整后，系统适用性应符合要求，且色谱峰出峰顺序不变。若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。对于梯度洗脱，调整其色谱参数应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎，因为此调整可能会使某些峰位置变化，造成峰识别错误，或者与其他峰合并。

可通过相关软件计算表 1 中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围，并根据色谱峰分离情况进行微调。若调整超出表 1 中规定的范围，调整的方法应进行相应的方法学验证。无论调整后的方法验证与否，当对其测定结果产生异议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。在品种项下一般不宜指定或推荐色谱柱的品牌，但可规定色谱柱的填料(固定相)种类(如键合相，是否改性、封端等)、粒径、孔径，色谱柱的柱长或柱内径；当耐用性试验证明必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。 检测器新增了电雾检测器 电雾式检测器(CAD)是一种新型通用型液相色谱检测器，与ELSD相比，C AD具有更高的检测灵敏度、更好的日内和日间重复性和更宽的线性范围。很多ELSD无法检测到的杂质，在CAD上具有较好的响应。与ELSD相比，难挥发性化合物的CAD响应与分析物的理化性质无关，在进入CAD的流动相组成不变的情况下，进样量相同的不同化合物具有相同的CAD响应。换言之，CAD可用已知化合物的线性曲线定量未知化合物。此外，CAD做化合物纯度分析所得数据更接近样品的真实组成。与UV相比，CAD的响应不受化合物紫外吸收基团的影响，半挥发和难挥发的化合物都能在CAD上具有较好的响应，可以检测UV无法检测到的弱紫外吸收化合物。

色谱参数的调整

应评价色谱参数调整对分离和检测的可能影响，必要时，调整的方法应进行相应的方法学验证。调整后，系统适用性应符合要求，且色谱峰出峰顺序不变。 ?若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性； ?若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。调整梯度洗脱色谱参数时应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎，因为此调整可能会使某些峰位置变化，造成峰识别错误，或者与其他峰合并。 新增了测定法项下定性分析项 明确规定了常用的定性方法主要有但不限于以下几种： 1、利用保留时间定性 保留时间(retention time)tR被定义为被分离组分从进样到柱后出现该组份大响应值时的时间，也即从进样到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，常以分(min)为时间单位，用于反映被分离的组分在性质上的差异。通常以在相同的色谱条件下待测组分的保留时间与对照品的保留时间是否一致作为待测成分定性的依据。在相同的色谱条件下，待测成分的保留时间与对照品的保留时间应无显著性差异；两个保留时间不同的色谱峰归属于不同化合物，但两个保留时间一致的色谱峰有时未必可归属为同一化合物，在作未知物鉴别时应特别注意。若改变流动相组成或更换色谱柱的种类，待测成分的保留时间仍与对照品的保留时间一致，可进一步证实待测成分与对照品为同一化合物。当待测成分(保留时间tR,1)无对照品时，可以样品中的另一成分或在样品中加入另一成分作为参比物(保留时间tR,2)，采用相对保留时间(RRT)作为定性(或定位)、校正因子计算含量的方法。在品种项下，除另有规定外，相对保留时间以未扣除死时间的非调整保留时间按下式计算。

若需以扣除死时间的调整保留时间计算，应在相应的品种项下予以证明。 2、利用光谱相似度定性 化合物的全波长扫描紫外-可见光区光谱图提供一些有价值的定性信息。待测成分的光谱与对照品的光谱的相似度可用于辅助定性分析。二极管阵列检测器可得到更多的信息，包括色谱信号、时间、波长的三维色谱光谱图，既可用于辅助定性分析，还可用于峰纯度分析。 3、利用质谱检测器定性 利用质谱检测器提供的色谱峰分子质量和结构的信息进行定性分析，可获得比仅利用保留时间或增加光谱相似性进行定性分析更多的、更可靠信息，不仅可用于已知物的定性分析，还可提供未知化合物的结构信息。