oracle的race技术,RACE技术之5'RACE技术比3'RACE技术的对比

RACE技术一般有两种RACE方法,分别用于扩增3'端或5'端.5'RACE技术比3'RACE技术更具有挑战性,其特异性较低,产物可能是单一产物、多个产物,甚至是不能分辨的连续条带.最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA 5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素.可利用巢式引物扩增(最多进行三轮巢式扩增),增加逆转录保温温度和PCR退火温度,降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5'RACE的特异性.本试验通过利用5'RACE技术获得播娘蒿CBF基因的5'端序列,对常用的环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法及SMART反转录酶法,3种5'RACE方法进行比较和优化.

一、试验材料

1、模板

播娘蒿在25℃下生长30 d后,将完整植株放置于4℃下冷驯化12 h后,取其叶片提取RNA.

2、引物设计与合成

根据已知播娘蒿CBF基因的EST序列,设计5'RACE反应所需引物.由于不同的原理,5'RACE有3种克隆扩增方法,因此根据不同的方法设计5'RACE引物DK 01、DK 04、DK 05、DK 06.此外合成RACE通用引物Oligo dT-3sites Adaptor Primer、3sites Adaptor Primer、5'-CDS Primer、SMART II oligo、UPM和NUP.引物合成及测序

二、试验方法

1、环化法

(1)、首链cDNA的合成 反转录体系如下:1.5μl 10×RT Butter,0.5 μl RNase Inhibitor,1 μl AMV Reverse Transcriptase XL,1 μl 5端磷酸标记反转录引物,5 μl总RNA,再加入RNase Free dH2O至总体积15 μl.反应条件为30℃反应10 min,50℃反应1 h,80℃反应2 min.

(2)、RNA的分解 反应体系如下:15μl cDNA反应液,15 μl5×Hybrid RNA Degeneration Buffer,再加入d H2O至总体积75 μl.将上述反应液加入1μl RNase H,30℃反应1 h;再加入100 μl灭菌蒸馏水,500 μl无水乙醇混匀后-20℃沉降30 min;12000 r离心10 min后去上清,用500 μl 70%乙醇洗涤后干燥.

(3)、通过连接反应将单链cDNA环化 向干燥的单链cDNA中加入8 μl的5×RNA(ssRNA)Ligation Buffer和12 μl的d H2O溶解,再加入20 μl的40%PEG#6000均匀混合,再加入1 μl T4 RNA Ligase,16℃反应24 h.

(4)、PCR反应 将上述反应液作为模板,以DK09与DK05为引物,用Ex Taq酶PCR,体系与反应条件与2.3相同,反应中退火温度为60℃;

将第一次PCR反应液稀释10倍后作为模板,以DK 04与DK 06为引物,用Ex Taq酶进行第二次PCR,反应体系和条件如前,仅条件中的退火温度改为50℃.将第二次PCR产物电泳观察结果.

2、末端脱氧核糖核酸转移酶法

(1)、首链cDNA的合成 将14 μl的RNA与0.5 μl的引物DK01和1 μl的RNase inhibitor混合均匀,70℃放置10min后冰浴1min,短暂离心;随后加入2.5 μl的10×RT Buffer,1.25 μl的dNTP Mixture(各10mmol/L)和2.25 μl的DTT(100 mmol/L),加去RNase水至总体积24 μl,混匀后42℃放置1 min,再加入1 μl的AMV Reverse Transcriptase XL,55℃下反应2 h,再70℃处理15 min后,短暂离心.

(2)、RNA的降解和cDNA的纯化 将前一步得到的25 μl cDNA和1 μl的RNase混合,37℃下放置30 min;随后加入80 μl无水乙醇沉降18h,12000 r离心10 min后去上清,加入100 μl的70%乙醇洗涤干燥,加入20 μl ddH2O溶解.

(3)、cDNA末端加尾 反应体系如下:5 μl 5×TDT Buffer,15 μl cDNA,2.5 μl 0.1%BSA,0.5 μl dATP(100mmol/L),加入ddH2O至总体积24 μl.将上述反应液94℃处理2~3 min后冰浴1 min,加入1 μl TdT,37℃放置12 h,然后65℃处理10 min,冰上冷却后短暂离心.

(4)、PCR反应 以上一步获得的反应液为模板,以DK01和Oligo dT-3sites Adaptor Primer为引物,用Ex Taq酶PCR,反应中退火温度为50℃,扩增15个循环;将第一次PCR的反应液稀释10倍为模板,以DK09与3sites Adaptor Primer为引物,用Ex Taq酶进行第二次PCR,反应中退火温度为60℃,扩增30个循环.将第二次PCR产物电泳观察结果.

3、SMART反转录酶法

(1)、首链cDNA的合成 将2 μl的RNA与1 μl的5'-CDS Primer、1 μl的SMART II oligo和0.5 μl的RNase inhibitor混合均匀,70℃放置5 min后冰浴2 min,短暂离心;随后加入2 μl的5×First-Strand Buffer,1 μl的dNTP Mix(各10mmol/L)和2 μl的DTT(100 mmol/L),混匀后再加入1 μl的PowerScriptTM Reverse Transcriptase,55℃下反应90min,加入50 μl的Tricine-EDTA Buffer稀释,再72℃处理7 min后,短暂离心.

(2)、PCR反应 将前一步获得的反应液为模板,以DK01和UPM为引物,用Ex Taq酶PCR,反应条件如下:94℃变性5 min;94℃反应30 s,72℃反应3 min,进行5次循环;94℃反应30 s,70℃反应30 s,72℃反应2 min,进行5次循环;94℃反应30 s,68℃反应30 s,72℃反应2 min,进行25次循环;然后72℃延伸10 min.

将第一次PCR的反应液用Tricine-EDTA Buffer稀释100倍为模板,以DK09与NUP为引物,用Ex Taq酶进行第二次PCR,反应条件如下:94℃变性5 min;94℃反应30 s,68℃反应30 s,72℃反应2 min,进行20次循环;然后72℃延伸10 min.将第二次PCR产物电泳观察结果.

三、结果与 分析

1、 环化法5’RACE

利用环化法5'RACE技术PCR的结果,在1%琼脂糖凝胶电泳中几乎看不见目的大小条带,甚至是成型条带的出现,仅仅能够模糊的观察到一些弥散的扩增产物.没有出现目的大小扩增片段的原因可能是播娘蒿CBF mRNA反转录出的首链cDNA自身形成了高级结构,不适合RACE反应中关键的环化反应的进行,从而导致后期的特异引物扩增无法进行下去.至于模糊的弥散扩增产物可能是由于模板使用的总RNA中包含了播娘蒿几乎全部的遗传信息,特异性引物与其它基因非特异性退火扩增造成的.

2、 末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5’RACE TDT酶法5'RACE技术PCR电泳结果如图2中的A道,在1%凝胶电泳中可以观察到一条弥散的扩增条带,大约在400~500 bp之间的位置可以隐隐约约地分辨出一条较亮的条带,但是由于处在弥散的扩增产物条带中,无法进行胶回收测序.弥散扩增产物的出现可能有多个原因,除了由于模板使用总RNA导致背景较为复杂,Oligo dT退火温度较低易形成错误扩增的因素外,最大的可能是由于mRNA 5'端的结构复杂,GC含量高,易形成二级结构,进而导致反转录出的首链cDNA长短不一,之后TDT酶进行加尾时在所有的cDNA 3'末端都加上了一条ploy A尾.而较短的cDNA相对于较长的cDNA更容易进行PCR扩增,因此导致后面的扩增出现弥散的条带.

3、 SMART反转录酶法5’RACE

利用SMART反转录酶进行5'RACE技术PCR电泳结果如图3中的A道,在1%凝胶电泳中可以明显观察到450bp左右的扩增条带,同时几乎没有非特异性扩增.导致5'RACE结果良好的原因除了由于SMART反转录酶本身的特性导致反转录到mRNA 5'末端才加上同聚尾的酶活性质外,还因为同聚尾与多聚引物采用G/C配对,这样后期的PCR中可以使用较高的退火温度,从而减少了引物与模板之间发生的非特异性扩增.

四、讨论

1、5’RACE 方法 的比较

通过分子克隆技术获得未知mRNA的5'端序列不容易取得成功.通常存在于cDNA基因文库中的部分克隆,由于反转录酶未能沿全长mRNA模板延伸完全,或起始mRNA模板过长或模板二级结构含量过高,导致合成的cDNA第一条链往往5'端不完整[4].以往 研究 者们通过调整试验条件反复筛选cDNA文库来获得全长的cDNA克隆,但经常试验结果令人失望.这种技术的唯一出路在于重新构建与筛选额外的cDNA文库,复杂又繁琐.1988年Frohman等提出了RACE技术,为获得mRNA的5'端序列提供了新的方法.

利用环化法5'RACE技术的原理即反转录后先用基因特异性引物PCR 扩增目的cDNA,接着在T4 RNA连接酶催化下使第一条cDNA 链环化,将得到的单链DNA做为模板, 用基因特异性引物进行PCR扩增5'端.因为这种方法的引物都是基因特异性的,所以非特异PCR产物基本上不会产生.但是在这种方法至关重要的关键性的环化中,可能由于mRNA的5端结构复杂,导致合成的第一条单链cDNA的3'端易形成高级结构,从而很容易导致环化反应失败.

末端脱氧核糖核酸转移酶法5'RACE技术原理即利用序列特异性引物1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,用脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)给反转录的首链cDNA加上polyA尾,以Oligo(dT)-Adaptor为引物合成第二条cDNA链.然后用接头引物Adaptor和位于延伸引物序列上游的序列特异性引物2进行PCR扩增.

SMART反转录酶法的5'RACE技术原理基本上与末端脱氧核糖核酸转移酶法相似,如图4.利用3'末端序列引物5'-CDS Primer反转录总RNA,与TDT法不同的是,SMART反转录酶自身有个特性,即当反转录到末端的时候,也就是RNA/DNA双链结构末端的时候,它会自动在DNA链末端加上3个G.然后通过与接头引物SMART II-oligo结合继续延伸.以SMART II接头部分的引物的Long UP扩增第二条cDNA链,随后再以序列特异性引物GPS1和与Long UP接头部分互补的引物Short UP进行PCR的扩增阶段.

三种方法比较而言,除了RACE的共通优势和缺陷外,各有各自的好处和不足.环化法5'RACE技术的优点在于得到的非特异性PCR产物会比较少,因为它采用的引物都是序列特异性的.但是它有个最大的缺点就在于环化反应,如果扩增基因的5'端结构复杂或者二级结构比较多,会导致环化反应的失败,无法扩增目的条带.末端脱氧核糖核酸转移酶法5'RACE技术不存在环化的 问题 ,整个方法 经济 便宜,但是也有不足.因为它使用的是TDT来进行poly dA加尾技术,一来poly dA与oligo dT的结合温度不高,PCR过程中容易出现错误扩增;二来TDT的连接效率很差,不容易加上poly dA尾.SMART反转录酶法5'RACE技术克服了上述缺点,它用G/C配对替代了A/T配对,利用反转录酶自身加上末端多聚体,但是它的缺点就在于价格过于昂贵,试验成本增加,而且对RNA质量要求很高.我们在具体试验中可以通过模板不同的性质和要求,选用不同的方法并对其进行适当的改进.

2、5’RACE技术的优化改进

尽管5'RACE的方法很有实用价值,但是许多研究中都观察到,要成功地 应用 这项技术还是很困难的.RACE技术的整个操作过程虽然非常简单,但是每个步骤都可能使其受到 影响 导致扩增失败.一般说来,失败的主要原因有两个.第一是反转录、加尾和PCR这三个连续的酶反应过程;第二是即使酶反应步骤能顺利进行,但常常会产生大量的非特异性或截短的产物背景.因此,自RACE技术出现及 发展 ,一直都伴随着对RACE的各个步骤的改良.

反转录失败原因是因为在5'RACE过程中,有时候会产生截短的cDNA,它具有与全长分子同样的末端,如一条引物在它们的3'末端,而同聚物尾在它们的5'末端.由于截短的cDNA在后继的PCR中会优先扩增,因此反转录应尽量避免产生不完整的cDNA.解决方法有二:第一,尽量保证获得高质量RNA,提高RNA的质量,为反转录提高良好的模板.第二,如果模板有较高的GC/AU比值,那么它比较容易在反转录过程中形成二级结构产生截短的cDNA.最好的解决方法是利用能在高温下进行有效反转录的嗜热DNA多聚酶进行反应.后期PCR结果失败的主要原因则是因为反转录的模板是总RNA, 理论可参考：http://www.biossci.com/index.php?m=article&a=lists&tid=175 上它包括了试验材料所有的基因信息,导致扩增引物错误配对,导致扩增出不相干条带信息.因此我们常常在注意设计高退火温度扩增引物同时,还在第一次PCR后采用巢式PCR以减少非特异性产物的产生.

以上是RACE技术所需要的共同的常用改良方法,针对此三种RACE技术,针对它们不同的特点进行了不同的改进.