伏马菌素B1(Fumonisin B1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是镰刀菌产生的水溶性有毒次生代谢产物，存在于几种常见的真菌毒素中。已知它们具有致畸性、致癌性、致突变性、免疫毒性、神经毒性、细胞毒性、肝毒性、肺毒性和肾毒性。它们经常存在于谷类、坚果、食品和其他副产品中，可导致急性或慢性疾病，并对人和动物造成不可逆转的损害。检测真菌毒素最常用的方法是仪器分析，仪器分析虽然结果定量、灵敏、可靠，但制备复杂、设备昂贵、步骤繁琐，不适合在基础实验室和现场常规检测。FB1和DON广泛存在于小麦和玉米等普通谷物中，也存在于一些中药中。在中国，每年都有许多中药生产和使用。目前，中草药的安全性问题已引起世界各国的广泛关注。中药材在培植和储存过程中很容易受到真菌毒素的感染，这不仅影响了药材的药效，而且长期食用受污染的药物，还会因毒素堆积而导致慢性中毒、器官损伤等不良反应。
采用金种子合成法制备的花状金纳米颗粒(FGNs)具有放射状的尖端、花枝或突起表面。由于其形态与海胆相似，也被称为熊果状的金纳米颗粒。虽然已经报道了使用基于FGN的ICS检测FB1和DON，但所有先前的研究都在谷物或食品中单独检测FB1或DON。本研究以FGN为抗体标记探针，建立了快速同时检测中药中FB1和DON的免疫层析试纸条 (ICS)。
传感原理
图一：试纸条的检测原理
试纸条的检测原理是基于测试线上的捕获试剂(FB1-BSA和DON-BSA抗原)和样品中的FB1(DON)对FGN-MAb的竞争。在没有FB1和DON的情况下，FGN-MAb分别与FB1-BSA和DON-BSA结合在T1和T2线，羊抗鼠抗体结合在C线，形成三条带。在FB1和DON存在下，FGN-MAb优先与其结合，削弱了FGN-MAb在FB1-BSA和DON-BSA之间的结合。因此，T1和T2线的颜色强度降低。T线的颜色强度与样品溶液中FB1和DON的浓度有关。此外，FGN-MAb与羊抗鼠抗体的结合物，不论样品溶液中是否含有FB1和DON，均在C线显色且颜色强度均保持不变。在本研究中，给出无色T线的FB1和DON的最小浓度被定义为视觉检测下限。
实验结果
图二：HAuCl4、金种子、对苯二酚的不同用量对合成FGN的影响
如图二A所示，当金种和对苯二酚的加入量不变时，随着HAuCl4浓度的增加，胶体金溶液的颜色从浅蓝色到深蓝色再到紫色。当HAuCl4和对苯二酚的浓度保持不变时，随着金种子量的增加胶体金溶液颜色由蓝色逐渐加深。在HAuCl4浓度和金种子量不变的情况下，随着对苯二酚含量的增加，胶体金溶液由红紫色变为蓝色，深蓝色。
如图二B所示，当金种和对苯二酚的加入量不变时，FGN的粒径随着HAuCl4浓度的增加而减小，支化程度逐渐减小，直至变为球形。在HAuCl4和对苯二酚浓度不变的情况下，FGN的粒径随着金种子量的增加而减小。在HAuCl4和金种浓度不变的情况下，FGN的尺寸随对苯二酚含量的增加而增大，表面支化程度增加。
因此金纳米粒子用于ICS的最佳条件为：HAuCl4溶液0.25mL，金种子液0.3mL，对苯二酚量0.5mL。
图三：FB1和DON-FGN-MAb探针的优化
将标记的FGN-DON和FB1抗体溶液以1：1的比例混合，均匀地喷洒在结合垫上。ICS的C线和T线的显色强度相近，但检测灵敏度有所提高。
图四：试纸条检出限测定(基于FGN和AuNSS的ICS对，A和C为分别检测FB1， B和D为分别检测DON， E为同时检测FB1和DON，FB1和DON的标准浓度为1~7：0.0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0和20.0 ng/mL)
FB1和DON用0.01M PBST稀释，浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0和20.0 ng/mL。将样品溶液(100l)滴在样品垫上测定检出限，用试条测定3次标准溶液。如图4所示，随着FB1和DON浓度的增加，T线上的颜色强度逐渐降低。在浓度为5.0 ng/mL时，测试线上的颜色强度小于负值(图4)。因此，5.0 ng/mL可作为FGN-ICS检测FB1和DON的视觉下限。此外，用FGN作为抗体标记探针制备的试条的灵敏度比用AuNSs制备的试条(20.0 ng/mL)高4倍，其原因可能是FGN的比表面积大于球形胶体金的比表面积。
图五：试纸条特异性和稳定性评价(A：FGN-ICS同时检测FB1和DON的特异性和稳定性。A空白组和霉菌毒素(1~6)：空白组：0 ng/mL；FB1：20 ng/mL；DON：20 ng/mL；AFB1：100 ng/mL；ZEN：100 ng/mL；OTA：100 ng/mL。FB1和DON的标准浓度分别为0、0.5、1、2.5、5、10和20 ng/mL。B：1~5天的试条保存温度和天数分别为：空白组未保存，25◦C保存1个月的空白组，37◦C保存3周的空白组，25◦C保存1个月的DON阳性组，37◦C保存3周的DON阳性组。)
如图5A所示，基于FGN同时检测FB1和DON的ICS与其他三种毒素(AFB1、ZEN和OTA)没有交叉反应，FB1或DON在低浓度和高浓度下都显示出显著的颜色差异，表明这些试条对FB1和DON具有很高的特异性。
37℃保存3周后，检测空白对照组和阳性试验组C、T线颜色变化，并测定3组平均值。如图5B所示，保存和未保存空白对照组的C线和T线的颜色没有明显变化。结果表明，37℃保存3周对T线、C线的颜色强度和试纸的灵敏度影响不大，说明试纸具有较好的稳定性。
表一：中药中FB1的ICS和ELISA检测结果，DON的ICS、HPLC和ELISA检测结果。
图六A 图六B：基于(A)FGN和(B)AuNSS的ICS检测中药中FB1和DON
将FGN-ICS用于中药材中FB1和DON的同时检测。47个中药样品是从当地市场、网上销售和其他地方购买的。中药材样品均为干燥植物，除43号(健生曲)外未加任何添加剂，健生曲是一种常用的中药，由面粉、麸皮和广藿香、青蒿等多种药物混合发酵而成。
由表一和图六可以看出，高效液相色谱和酶联免疫吸附测定结果与试纸条的呈现良好的一致性。ICS从46份标本中提取的FB1阳性标本，ELISA检测浓度为1 mg/kg。用高效液相色谱和酶联免疫吸附试验(ELISA)从43号样品(健生曲)中提取的DON阳性样品的浓度为1.0 mg/kg。用较低浓度(不含1.0 mg/kg)的HPLC或ELISA检测的样品，ICS试验均为阴性。因此，本文研制的两种ICS均适用于现场大批量样品的筛选。此外，使用基于FGN的ICS获得的结果与使用基于AuNSS的ICS获得的结果完全一致。
评价：
利用FGN制备了可以同时检测伏马菌素B1(Fumonisin B1，FB1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的免疫层析试纸条 (ICS)。该试条的灵敏度为5.0 ng/mL(相当于中药样品中的50μg/kg)，检测时间为5min。
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参考文献：Xinyu Huang, Ting Huang, Xiujiang Lic, Zhibing Huang.Flower-like gold nanoparticles-based immunochromatographic test strip for rapid simultaneous detection of fumonisin B1and deoxynivalenol in Chinese traditional medicine. doi:https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112895.
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