利用瑞利里兹方法计算固有频率的程序_亚琛工业大学 计算化学方向 之OPT学习笔记第二部分 第十一节 超高解析度显微镜...

第二部分

第一节 电子状态

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第二节 振动光谱IR和Raman

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第三节 吸收光谱

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第四节 荧光光谱

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第五节 荧光发光团

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第六节 荧光猝灭 (Fluoreszenzlöschung)

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第七节 时间分辨荧光光谱(zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie)

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第八节 荧光各向异性(Fluoreszenzanisotropie)

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第九节 荧光相关光谱FCS(Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie)

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第十节 荧光显微镜(Fluoreszenzmikroskopie)

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第十一节 超高解析度显微镜 (Superauslösende Fluoreszenzmikroskopie)

影像分辨率能超越衍射极限，光的衍射会造成传统光学显微镜分辨率的极限：一数值孔径N.A.，且入射光波长为λ的具衍射极限的显微镜的水平分辨率为

，垂直分辨率(z方向)也可以用同样的表达式给出。

一个标准的光学显微镜分辨率在可见光范围约为水平200奈米、垂直600奈米。实验上，可达到的分辨率可量取点状物体的点扩散函数的半峰全宽求得。虽然显微镜的解析力并未完整定义，目前公认超高分辨率显微镜技术可达到比阿贝所定义的分辨率。

超高分辨率显影剂术包含单分子局域分析法、光子穿隧显微术、以及利用超级透镜、近场扫描式光学显微镜、4Pi显微镜、共聚焦显微镜(将针孔关闭)、或是经过反褶积、侦测器相素重配等计算处理后的共轭焦显微镜影像，也包含利用结构性光源的险微镜技术(例如SIM以及垂直显像SIM)。

目前有两种主要的功能型超高分辨率显微镜学：

1. 决定性超高分辨率：常用在生物显微镜的发光物─荧光色素，受激后有非线性反应，此非线性反应可以用来提高分辨率，这些方法包括诱发发射性显微术、激态抑制性显微术、可逆饱和光学荧光转换和SSIM。
2. 随机性超高分辨率：分子光源的化学复杂性提供时间域上的复杂表现，可以让许多非常接近的萤光色素在不同时间发光，因而可以在不同时间解析不同分子。这些方法包括超分辨律光变成像(SOFI)和全单分子局域方法(SMLM)如 垂直现象、光活化局域性显微镜法, FPALM、STORM和dSTORM。

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对单个分子的考虑(Beobachtung einzelner Moleküle)：

衍射极限(Beugungslimit):有关物镜的信息, 通过观察波长数值孔径的有限值(Information über Objekt ist durch Beobachtungswellenlänge und numerische Apertur begrenzt)。导致一个高的频率是被隔断的(hohe Frequenzen sind abgeschnitten)

衍射极限对荧光成像的影响(Auswirkung des Beugungslimits auf die Fluorezenzbildgebung):

a)确定一个物象的位置是可能的，如果其他物象跟其位置没有重叠(Bestimmung der Positionen einzelner Objekte möglich )

b)确定一个物象的位置是不可能的，如果其他物象跟其位置有重叠(Bestimmung der Positionen einzelner Objekte NICHT möglich(Überlappung))

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荧光显微镜的空间分辨率 (Räumliche Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie ):

d：可以分辨的两个光点之间的最小距离（垂直于光轴的方向）(d: minimale Entfernung zweier Lichtpukte, die aufgelöst werden kann (in Richtung senkrecht zur optischen Achse) )

瑞利准则： 两个相邻点被认为是可以分辨的，当一个峰的中央最大值的位置和另一个的衍射最小值相匹配。

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数值孔径（NA）(Numerische Apertur)

光学系统的数值孔径（NA）是一个无量纲的数，用以衡量该系统能够收集的光的角度范围。在光学的不同领域，数值孔径的精确定义略有不同。在光学显微镜领域，数值孔径描述了物镜收光锥角的大小，而后者决定了显微镜收光能力和空间分辨率；在光纤领域，数值孔径则描述了光进出光纤时的锥角大小。

激光光束在传播过程中，发生角度很小的发散。在远离光束最窄点的地方，光束的发散程度与传播距离大致呈线性关系——相当于光束在“远场”形成了一个圆锥。

n是介质的折光率， 在前镜和显微镜之间。 但

是半角，它的定义则与之前所述不同。激光光束的并不是一个因受到光阑限制而产生的锐利圆锥，而是一个辐照度随着离光束中心距离而逐渐降低的高斯光束。针对这种情况，激光物理学家们选择用光束的发散程度来定义

，也就是

由光的传播方向，以及辐照度降低到波前总辐照度

时距光束中轴的距离决定。对于高斯激光束，其数值孔径与激光最小束斑尺寸有关（其数值孔径表示激光的发散程度，激光发散程度与激光最小光束直径有关）：

其中

是激光在真空中的波长，

是光束最窄处的束斑直径（相当于辐照度衰减到

时的全宽）。这意味着聚焦在小束斑上的激光会很快发散，而束斑直径较大的激光则能在很长的传播距离中几乎保持直径不变。

数值孔径决定了镜头的分辨度。

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超分辨率荧光显微镜法(Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie Methoden)

a) 基于位置的方法 Lokalisierungsbasierte Methoden

PALM, STORM, dSTORM

分辨率非常好，（非常）慢，中等强度的光 (sehr gute Auflösung, (sehr) langsam, mäßige Lichtintensität)

1 随机切换荧光团 stochastisches Schalten von Fluorophoren

2 确切位置 genaue Lokalisierung

3 超分辨图像是从许多单独的位置生成的 superaufgelöstes Bild wird aus vielen einzelnen Lokalisierungen erzeugt

b) 扫描方式 Scan-Methoden

STED, RESOLFT

非常）高分辨率，快速扫描，高激光强度 ((sehr) gute Auflösung, schnelles Scannen, hohe Laserintensitäten )

1 样品被扫描 Probe wird gescannt

2 衍射极限激发 beugungslimiterierte Anregung

3 围绕中心位置进行有针对性的激励会提高分辨率 gezielte Abregung um zentrale Position führt zu Auflösungsgewinn

c) 结构化的光照和图像关联方法(strukturierte Beleuchtungs- und Bildkorrelations Methoden)

SIM, SOFI

中等分辨率，非常快，中等强度的光(mäßige Auflösung, sehr schnell, mäßige Lichtintensität)

1 用干涉图案调制激发光 Modulation des Anregungslichts mit Interferenz-Mustern

2 使用复杂算法进行评估 Auswertung mit komplexen Algorithmen

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基于定位的超分辨率成像 Localization-based superresolution imaging

是空间分辨率 räumliche Auflösung；

是像素面积 Pixelfläche；s 是衍射极限点扩展函数的标准偏差（

） Standardabweichung der beugungslimitierten point spread function; b 是背景噪音(最小值) Hintergrundrauschen(minimieren)；N 是每像素光子数(最大值) Photonenzahl pro Pixel(maximieren)

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受激发射损耗荧光显微术(Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie)

突破光学衍射极限的办法之一是近场光学显微镜，它是利用探针探测样品表面的隐失场而获得样品表面信息。

受激发射损耗（STED） 荧光显微术是一种可以突破光学衍射极限的远场光学显微术。

在常规光学显微系统当中，由于光学元件的衍射效应，平行入射的照明光经过显微物镜聚焦之后在样品上所成的光斑并不是一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在该衍射斑范围之内的样品均会由于被照明光照射而发出荧光，使得该范围内的样品细节信息没有办法被分辨，从而限制了显微系统的分辨能力。为了突破衍射极限的限制，实现超分辨显微，如何减小在单个扫描点处的有效荧光发光面积便成为了关键。

在STED显微术中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的STED显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率。

STED显微术能实现超分辨的另一个关键在于受激发射与自发荧光相互竞争中的非线性效应。当损耗光照射在激发光斑的边缘位置使得该处样品中的电子发生受激发射作用时，部分电子不可避免地仍然会以自发荧光的方式回到基态。然而当损耗光的强度超过某一阈值之后，受激发射过程将出现饱和，此时以受激发射方式回到基态的电子将占绝大多数，而以自发荧光方式回到基态的电子则可以忽略不计。因此，通过增大损耗光的强度，使得激发光斑范围内更多范围的自发荧光被抑制，可以提高STED显微术的分辨率。

荧光的体积小于衍射极限(Fluoreszenz von Volumen kleiner als Beugungsgrenze)：

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思维导图：