python去除图像光照不均匀_封面| 眼见为实，高速超分辨结构光照明显微更快更清晰...-CSDN博客

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本文详细介绍了高速超分辨结构光照明显微技术的关键技术，包括条纹光场的产生、偏振控制和系统同步，以及图像重构中的参数测定、反卷积和噪声处理。文中提及赵天宇对SIM技术的综述，强调了提高分辨率和解决重构伪影的挑战，并展望了SIM技术在生命科学和生物医学领域的应用潜力。

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本文为中国激光第2032篇。

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西安交通大学雷铭团队在《激光与光电子学进展》发表题为“高速超分辨结构光照明显微的关键技术及应用”的特邀综述文章，重点介绍了结构光照明显微技术的硬件设计与图像重构算法中关键的实验要点与技术难点，列举了其在生物成像中的应用，探讨了结构光照明显微技术未来的发展方向。

封面文章|赵天宇,汪召军,冯坤,梁言生,何旻儒,云雪,雷铭. 高速超分辨结构光照明显微的关键技术及应用[J]. 激光与光电子学进展, 2020, 57(24): 240001

撰稿：赵天宇(西安光机所)

一、背景

超分辨光学成像技术是近几十年来发展最快、受关注度最高的光学成像技术之一。目前主流的超分辨光学成像技术大体包括三类：基于单分子定位的显微成像技术(SMLM)、基于光学系统点扩展函数调制的受激发射损耗显微成像技术(STED)和基于空间调制照明的结构光照明显微成像技术(SIM) 。在现有的超分辨光学成像技术中，SIM具有最快的成像速度和极低的激发光功率密度，并且与传统的荧光分子兼容，因而在活体细胞及其结构的动态行为观测中备受青睐。自2000年Gustafsson提出了经典的二维SIM技术以来，SIM技术受到了广大专家学者的关注，一系列相关技术改进和应用相继产生。

此文章主要对此进行了综述和讨论。希望通过对SIM技术的硬件设计和图像重构等方面的综述，帮助研究者们了解SIM技术的基本原理、发展历程和关键技术要点，为研究人员提供一个自行设计SIM系统的攻略。

二、硬件设计

通过分析SIM的条纹光场产生、光束偏振控制和系统同步时序三个方面的技术难点与解决方案，为研究者设计搭建SIM系统提供指导。

图1 干涉式SIM光路图

2.1 条纹光场的产生和相移控制

如何产生条纹结构光场是SIM实验装置的核心。Lu-Walther等人提出了一种查找光栅组的方法，实现了对光栅常数、方向、相移和衍射效率的定量计算，优化了每个光栅的像素分布。算法流程如图2所示。

图2 迭代法查找SLM加载光栅图样的流程图

2.2 偏振控制

SIM受重构算法的限制。

条纹对比度影响重构参数的测定准确度与高频信息的信噪比，进而影响最终的重构图像质量，所以高条纹对比度是获得高品质图像的必要条件。干涉条纹对比度受光偏振态影响较大，只有在线偏振入射光偏振方向与条纹方向呈特定角度时，条纹对比度才能达到最高。此外，为保证结构光照明显微系统OTF的各向同性，需要旋转条纹光场，通常以三个条纹方向相互成60°的条纹光场照明样品。为了保证三个方向都能实现较高的条纹对比度，还需要随着条纹方向的旋转而同步改变光束的偏振方向。

目前常用的偏振控制方法有两种。第一种是Förster等提出的pizza偏振片法。第二种方法是Kner等提出的使用相位延迟器进行偏振控制。相位延迟器法虽然需要额外的控制器与同步装置，操作复杂并且成本较高,但其适用于需要多种照明波长的情况，具有连续调节偏振方向、精度高、适用范围广的优点，同时也可用于补偿后续光路带来的偏振损失。

图3 FLC偏振控制原理

2.3 系统同步与控制

随着硬件的不断改进，SIM成像速度越来越快，需要对系统各个器件进行精确的同步控制。以本课题组自行搭建的SIM系统为例，介绍了SIM系统的同步控制时序，如图4。

图4 SIM时序图

三、图像重构

SIM通过改变照明光的空间结构，使记录的图像含有更多高频信息，再利用特定的算法将信息分离出来，进而重构出超分辨图像。然而频谱分离和反卷积过程中会遇到如原始图像信噪比低、参数测定不准确等问题，如何减小这些问题带来的伪影一直是SIM研究的重点。

3.1参数测定

初相位φ是SIM重构过程中最重要的参数，由于初相位φ位于指数项，估算不准确会造成重构图像中严重的伪影。2016年Zhou等人发现可以利用3幅原始结构光图像之间的相互关系，得到初相位的精确值(IRT)。这一算法利用三幅原始图像间的相位差，大大提高了初相位的估计精度，特别适用于弱荧光成像，如图5。

图5 不同初相位估计方法的结果对比。(a) 普通宽场反卷积的结果; (b)~(d) 三种初相位估计算法的超分辨重构图像; (e)~(h) 局部放大结果。其中标尺(a)~(d) 为5 μm，图(e)~(h)为500 nm

3.2反卷积和噪声处理

在光学显微领域，反卷积通常指用于反转在光学显微镜中由于衍射引发成像模糊的过程，从而创建更清晰的图像。

SIM中反卷积最常见的方法是维纳滤波法，但却不能很好地适应超分辨重构后复杂的频谱情况。对此，人们改用RL(Richardson-Lucy)反卷积和TV(Total Variation)反卷积，可改善离焦背景和频谱均匀性对重构结果的影响。

带来伪影的另一个原因是原始图像的低信噪比。2018年北京大学陈良怡课题组借鉴人眼区分信号和噪声的机制，提出将“生物样本在多维时空上连续，而噪声是完全随机分布”的先验知识用于构建海森矩阵，指导SIM图像重建，在传统反卷积之后进一步优化图像，去除随机噪声和伪影，如图6。

图6 密集肌动蛋白骨架结构的海森重构结果。(a)宽场结果、传统维纳滤波结果和海森重构结果对比，标尺为2 μm; (b)不同反卷积方法结果的局部放大图，标尺为500 nm

3.3超分辨图像的实时显示

SIM的图像采集速度是目前所有超分辨技术中最快的，但是超分辨图像的重构需要不断进行空域-频域转换以及使用迭代算法查找参数，计算开销巨大。相比于数十ms的图像采集速度，数分钟的图像重建时间过长。为此，Markwirth等通过引入GPU加速技术，利用GPU更擅长对图像和图形进行运算的特点，用不同处理器进行数据采集和图像重构，将重构时间压缩到20 ms，实现了SIM超分辨结果的实时显示，如图7。

图7 实时显示SIM技术的数据处理流程图

四、总结

SIM作为一类超分辨显微成像技术，突破了传统光学成像中的衍射极限，成为研究活细胞结构的利器。未来，更高分辨率的成像结果和更快的成像速度仍然是SIM追求的主要目标。

首先，相较于其他超分辨显微成像技术几十纳米到几个纳米的分辨率，SIM仅100 nm左右的分辨率仍显不足。

其次，由于SIM的图像重构本质上是一个病态反问题的求解过程，所以一直以来图像重构过程中容易出现重构伪影。

最后，目前大多数的高速SIM技术都受限于实验硬件的性能，如果能减少原始图像数量，从原理上提升SIM的成像速度，将会给SIM技术带来新的飞跃。另一方面，SIM还可以和其他技术进行关联以实现更多的功能和应用。自适应光学技术、偏振探测技术、新型荧光探针的发明和深度学习和人工智能技术等都有望带给SIM更多可能

眼见为实，光学显微一直是探索微观世界不可或缺的工具。SIM凭借着低光功率、高时间分辨率和不限制荧光染料等优势，具有很大的应用前景和发展潜能。SIM技术的不断进步将会在生命科学领域和生物医学领域产生越来越多的贡献。

End

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