在构建荧光适配体传感器时，荧光共振能量转移(FRET)是一种常用的策略，它是荧光团(给体)在10 nm范围内将其能量传递给猝灭剂(受体)的一种非辐射过程。作为一种新兴的二维层状纳米材料，CoOOH纳米片因其优异的光学、电学和热学性质而被认为是淬灭剂候选材料。例如，陈等人提出了一种用于检测抗坏血酸的荧光纳米探针，即掺镧上转换纳米颗粒(UCNPs)和CoOOH纳米片状纳米复合材料。李等人利用金纳米簇(AuNCs)-CoOOH纳米片复合材料，基于CoOOH纳米片的氧化还原反应，设计了一种灵敏检测吡虫啉的传感平台。然而，在这些基于CoOOH的FRET体系中，多采用制备工艺复杂的UCNPs、剧毒的金属纳米团簇或有机荧光染料作为供体，因此在提高溶解性、降低毒性和简化步骤等方面还需要做很多工作。
本工作首先以适配体修饰的g-CNQDs(g-CNQDs-apt)和CoOOH纳米片为供体-受体对，研制了一种基于FRET的检测OTA的新型荧光适配体传感器(示意图)。对于FRET体系，g-CNQDs-apt通过范德华力组装在CoOOH纳米片上，导致g-CNQDs-apt的荧光猝灭。通过OTA对适配体的特异性识别，在OTA的加入下，形成与CoOOH纳米片亲和力相对较弱的G-四链体，实现了OTA浓度依赖性的荧光恢复。该荧光适配传感器不仅操作简单、快速、成本低、选择性高，而且可以很好地应用于玉米和大麦粉中的OTA分析。
基于g-CNQDs和CoOOH纳米片之间的FRET的荧光适配传感器用于OTA检测的示意图
结果与讨论
1)g-CNQDs和g-CNQDs-apt的表征
通过FT-IR技术、XPS、拉曼光谱对g-CNQDs(图S1)进行表征，结果说明了成功制备g-CNQDs。用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了g-CNQDs的光学性质。如图所示(S2)，g-CNQDs在日光下呈淡黄色，在365 nm紫外光下呈蓝色。g-CNQDs的荧光光谱分别在390 nm和460 nm处出现最大激发峰和发射峰。经OTA适配体修饰后的g-CNQDs-apt不仅具有g-CNQDs的特征吸收峰，而且在257 nm处有明显的吸收峰，这归因于适配体的吸收(图1A)。为了进一步证明g-CNQDs与OTA适配体的成功缩合，进行了琼脂糖凝胶电泳。如图1C所示，对于速度较快的纯OTA适配体(36bp)，可以明显地观察到三个平行通道的带(通道a)。然而，由于g-CNQDs与g-CNQDs结合后g-CNQDs-apt的质量增加阻碍了通过水凝胶孔隙的平移运动，所以g-CNQDs-apt(通道b)的移动慢于纯适配体的移位，这是因为g-CNQDs-apt与g-CNQDs结合后的质量增加阻碍了水凝胶的平移运动。速度的改变进一步表明g-CNQDs-apt制备成功。
图1. (A)g-CNQDs、OTA适配体和g-CNQDs-apt的紫外-可见吸收光谱。(B)g-CNQDs和g-CNQDs-apt的荧光发射光谱。(C)OTA适配体的凝胶电泳图像(通道a)和g-CNQDs-apt的凝胶电泳图像(通道b)。
图S1(A)g-CNQD的TEM图像， 插图是g-CNQD的大小分布(a)和代表性HRTEM图像(b)。(B)g-CNQDs的FT-IR光谱。(C)X射线光电子能谱和g-CNQDs的相应高分辨率(D)C 1s光谱和(E)N 1s光谱。(F)g-CNQDs的拉曼光谱。
图S2 g-CNQDs的UV-Vis吸收和FL光谱。插图：在白色(左)和365 nm紫外线(右)光照下的g-CNQDs溶液。
2)CoOOH纳米片表征
SEM(图2A)和TEM图像(图S3A)明显表明CoOOH纳米片的形貌为典型的六边形，直径约为73 nm，与以前的报道相吻合。然后，FT-IR光谱(图2B)确认了CoOOH纳米片的表面组成。同时，通过XPS分析进一步观察到这些基团(图S3B和图2C)，这进一步证实了CoOOH纳米片的成功制备。1mg.mL-1CoOOH纳米片的紫外-可见光谱(图2D)显示出相对较宽的吸收带(从340到800 nm)，表明该光谱与不同的荧光给体有很好的重叠潜力。
图2.(A)SEM图像，(B)FT-IR，(C)高分辨率Co 2p和(D)CoOOH纳米片的紫外-可见吸收光谱。
3)检测OTA的可行性和机理研究
为了证实CoOOH纳米片对g-CNQDs-apt具有良好的猝灭能力，研究了加入不同浓度CoOOH纳米片后g-CNQDs-apt的荧光。结果表明，g-CNQDs-apt的荧光强度随CoOOH纳米片浓度的增加而逐渐减弱，当浓度达到200μg.mL−1时，荧光猝灭达90%。在此基础上，对所研制的适配体传感器的可行性进行了研究。如图3B所示，g-CNQDs-apt(0.15mg.mL−1， a线)发出强荧光(11.70×104a)在390 nm激发下，波长为469 nm。加入10μg.mL−1CoOOH纳米片后，g-CNQDs-apt的荧光猝灭23.00%(b线)。然而，加入OTA后，OTA与其适配体特异性结合形成G-四链结构。G-四链体与纳米片的相互作用力弱于线性适配体的作用力，导致G-四链体从CoOOH纳米片表面脱落，阻碍了g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片之间的FRET。结果表明，加入50 nM的OTA后，g-CNQDs-apt的荧光恢复到原值(c线)的86.5%，表明所建立的荧光适配体传感器用于OTA检测的可能性。
通过监测g-CNQDs-apt在无猝灭剂和存在猝灭剂的情况下的荧光寿命，了解CoOOH纳米片对g-CNQDs-apt的猝灭机理。G-CNQDs-apt的荧光衰减曲线符合图3C所示的三指数拟合，计算出g-CNQDs-apt的寿命为3.23 ns(表S1)。加入CoOOH纳米片后，g-CNQDs-apt的寿命降低到1.28 ns？寿命变化表明荧光猝灭属于动态猝灭机制。在OTA存在下，g-CNQDs-apt的寿命恢复到1.47 ns，进一步证明了g-CNQDs-apt的动态猝灭过程。如图3D所示，CoOOH纳米片在约436 nm处的吸收峰非常宽，并且与g-CNQDs-apt在469 nm处的发射峰有相当大的光谱重叠。因此，特定的猝灭机理属于FRET，能量从g-CNQDs-apt的激发态转移到CoOOH纳米片上。
表S1 g-CNQDs-apt，g-CNQDs-apt + CoOOH和g-CNQDs-apt + CoOOH + OTA的荧光寿命的拟合结果
图3. (A)g-CNQDs-apt与添加不同浓度的CoOOH纳米片(从上到下：0、25、50、75、100、125、150、175、200μg.mL−1)的荧光。(B)荧光发射光谱和(C)g-CNQDs-apt(a线)、g-CNQDs-apt+CoOOH(b线)和g-CNQDs-ap t+CoOOH在OTA存在下的时间分辨荧光衰减(c线)。(D)CoOOH纳米片的紫外-可见吸收光谱和g-CNQDs-apt的荧光发射光谱。
4)适配体传感器条件优化
为了提高分析性能，详细考察了g-CNQDs-apt和CoOOH纳米片的浓度、g-CNQDs-apt与CoOOH纳米片之间的吸附时间、OTA与OTA适配体结合时间等实验参数对适配传感器性能的影响。
恢复的荧光强度用ΔF(ΔF=F2-F1)表示，其中F1和F2分别表示g-CNQDs-CoOOH体系中没有和存在OTA时gCNQDs-apt的荧光强度。如图4A所示，ΔF从0.05mg.mL−1逐渐增加到0.15mg.mL−1。但当g-CNQDs-apt浓度超过0.15mg.mL-1时，ΔF逐渐下降，表明过量的g-CNQDs-apt不利于荧光的恢复。因此，选用0.15mg.mL−1 g-CNQDs-apt。图4B显示了当添加不同浓度的CoOOH纳米片时，在OTA存在下g-CNQDs-apt的荧光恢复。随着CoOOH纳米片浓度的增加，ΔF逐渐增大，当CoOOH纳米片浓度超过10μg.mL−1时，ΔF值开始减小。这可以归因于高浓度时CoOOH纳米片的溶解性不佳，因此过量的CoOOH纳米片会影响荧光强度。因此，CoOOH纳米片的最佳浓度为10μg.mL−1。
CoOOH纳米片与g-CNQDs-apt之间的吸附时间是一个关键参数。如图4C所示，g-CNQDs-apt的荧光猝灭是一个快速的过程，在加入CoOOH纳米片后5min内达到平衡，进一步表明CoOOH纳米片在FRET过程中作为有效的受体具有良好的性能。为了完成g-CNQDs-apt到CoOOH纳米片的组装，选择10min。最后，OTA和适配体之间的作用时间对ΔF的影响如图4D所示。显然，随着结合时间从0逐渐延长到5min，ΔF达到最大值。之后，ΔF基本不变，因此选择10min。
图4.实验参数的优化：(A)g-CNQDs-apt的浓度，(B)CoOOH纳米片的浓度，(C)gCNQDs-apt与CoOOH纳米片之间的吸附时间，(D)OTA与其适配体的结合时间。误差条是三个实验的标准偏差。
5)用于OTA分析的适配体传感器分析性能
在最佳实验条件下，考察了用于OTA分析的荧光适配传感器的分析性能。图5A中，适配体传感器的荧光发射强度在1-140nM (0.39−56.53ng.mL-1)范围内随OTA浓度的增加而增加。线性回归方程为ΔF=0.35182+0.18449 COTA，相关系数为0.9960(图5A)，检出限为0.5nM(0.20ng.mL-1,S/N=3)。对已报道的几种OTA检测方法的分析性能进行了比较。从表1可以看出，开发的荧光适配传感器与基于色谱的组合方法如HPLC-FLD、UPLC-MS/MS和ELISA相比显示出相似的线性范围。然而，荧光适配体传感器的操作过程相对简单。与电化学生物传感器相比，所提出的荧光适配传感器可以避免复杂的电极修饰。最后，对基于纳米材料的同类荧光生物传感器也进行了比较。这些荧光生物传感器的线性范围和检测下限为但由于采用了合成工艺简单、猝灭性能较好的CoOOH纳米片作为猝灭剂，使得所研制的FRET基适配体传感器操作更简单、成本更低，显示了该方法在实际样品中的应用潜力。
表1 几种报告的检测OTA方法的分析性能的比较
为了研究该适配体传感器检测OTA的特异性，利用基于FRET的适配体传感器对OTA和其他真菌毒素的类似物进行了检测。其中，NAP和OTB的分子结构与OTA相似，华法林在人血清白蛋白中与OTA具有相同的结合位点。如图5B和100 nM干扰所示，g-CNQDs/CoOOH体系(第1-6列)的荧光强度略有变化，这应归因于OTA适配体不能特异性识别干扰的事实。然而，当加入OTA时，g-CNQDs-apt的荧光信号显著增加(图5B，第7列)，这得益于OTA与其适配体之间的特殊结合。此外，还采用OTA和干扰混合的方法，考察了检测的特异性。结果表明，加入混合物后，g-CNQDs-apt的荧光恢复率与纯OTA(图5B，第8列)的荧光恢复率一致，表明所提出的适配体传感器确实可以特异性地检测OTA。因此，这些结果表明该适配传感器具有良好的选择性。
图5.(A)用于OTA检测的线性校准曲线。插图为加入OTA后g-CNQDs-apt的荧光光谱(从下到上：0，1，5，20，35，50，65，80,100,120,140 nM)。(B)适配子传感器的检测选择性。AFB1、FB1、NAP、OTB、华法林、ZEN和OTA的浓度均为100 nM。误差条是三个实验的标准偏差。
6)玉米和大麦粉中OTA的分析
为了评价所研制的荧光适配传感器在样品中有效应用的可行性，在玉米和大麦面粉中加入不同浓度的OTA标准溶液(10，50,100 nM)。如表2所示，添加玉米粉的回收率在97.5-99.8%之间。同时计算了3次不同浓度重复加标样品的相对标准偏差(RSD)小于2.09%。添加大麦粉的回收率在95.4%~101%之间，相对标准偏差在2.24%以下。这些结果表明，该适配传感器可以用于粮食中OTA的选择性检测。
表2 用荧光适配体传感器分析玉米和大麦粉中添加的OTA(n=3)
评价：
1.CoOOH首次被用作g-CNQDs的受体以开发FRET系统。
2.设计了一种新型荧光适配体传感器，用于选择性检测OTA且在检测OTA方面显示出出色的分析性能。
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本文参考文献：Bi X, Luo L, Li L, et al. A FRET-based aptasensor for ochratoxin A detection using graphitic carbon nitride quantum dots and CoOOH nanosheets as donor-acceptor pair[J]. Talanta, 2020: 121159.
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