流式凋亡率计算_临床研究：灵芝孢子油通过下调miR21促进人肺腺癌SPCA1细胞凋亡...

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肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，常规化疗药物尽管其抑制或杀伤肿瘤细胞的作用肯定，但其不良反应及多药耐药性难以克服。从中草药以及天然植物中开发抗肿瘤药物或通过膳食预防肿瘤，近年来已经成为研究的热点之一［1］。灵芝孢子中含有三萜类、多糖类、核苷类、生物碱类、呋喃衍生物类、多种酶类、氨基酸多肽类、甾醇类、多种微量元素及有机锗、脂肪酸等十几类近千种化合物(复合物) 。具有生理活性的成分主要有三萜类、多糖类、核苷酸类、氨基酸、微量元素及有机锗、生物碱类［2］。灵芝及其提取物不仅可通过提高免疫力 抑制肿瘤，还具有直接抗肿瘤作用［3］。研究发现灵芝多糖以及三萜类都具有抗肿瘤作用［4-5］。但灵芝的免疫调节及抗肿瘤作用机制尚未十分明确，仍有许多问题尚待解决［4］。微小 RNA在肿瘤里缺失或者不正常的扩增表达，表明 miRNAs是一类参与人肿瘤形成的基因［6］。miR-21被认为是参与肿瘤发生发展最显著的一个miRNA 分子之一。这是因为它不仅促进肿瘤的生长、增殖、抗凋亡和对抗肿瘤药物的应答，而且研究发现miR-21在很多肿瘤里面都过表达［7］。以往的研究表明miR-21过表达与 NSCLC病人的不良预后有关，而且抑制miR-21 可以抑制A549细胞的生长。所有的这些都表明 miR-21是微小RNA分子中最可能具有原癌基因性质的miRNA分子之一［8］。miR- 21通过转录后调控来下调肿瘤抑制因子PDCD4和PTEN 的表达，从而促进肺癌的浸润和迁移。本实验研究灵芝孢子油对肺癌SPC-A1细胞株中miR-21 及其靶基因表达的影响以及凋亡诱导作用，从 miR- 21基因表达和调控的角度来探讨灵芝孢子油抗肿瘤机制。

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材料

1.1 细胞培养 

人肺腺癌细胞系(SPC-A1) 引自中国科学院上海细胞所，常规培养于含10%灭活小牛血清、100U·mL－1 青霉素和0.1 g·L－1 链霉素的 RPMI 1640培养液中，置饱和湿度，37 ℃，5%CO2孵箱中培养。 

1.2 药物及试剂 

灵芝孢子油由南京中科药业有限公司馈赠，纯度大于99% ; RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司; 反转录试剂盒购 自TaKaRa公司; 实时荧光定量PCR用SYBR green mix购自Roche公司; CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所; Annexin.V.FITC/PI凋亡试剂盒购自Sig-ma-Aldrich; 引物由Invitrogen( 上海)公司合成。

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方法

2.1 细胞准备及试验分组 

肺癌SPC-A1细胞培养于含10%FBS的 RPMI 1640培养基中，置于37℃，5%CO2潮湿空气的培养箱内培养，2～3d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。实验分为对照组、灵芝孢子油0.05%，0.1% ，0.2%组等4组，分别处理 24，48h进行相应检测，倒置显微镜下观察各组 细胞形态变化情况。 

2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 

在96孔培养板上接种4组细胞，每组24复孔，每孔以1×104细胞浓度进行接种，接种 24，48h待测孔加入CCK-8试剂10μL，培养箱孵育4h后用酶标仪测定450nm处的吸光度值 A，每次每组测定6复孔。以培养液做空白对照并调零，测3次，取平均值。细胞增殖抑制率=1－ (A实验组 /A对照组)×100% 。 

2.3 流式细胞仪检测灵芝孢子油对SPC-A1 细胞凋亡率的影响 

收集处于对数生长期的SPC-A1细胞，接种于24孔板，每孔细胞数2×105个，细胞贴壁后，弃上清。加入不同浓度灵芝孢子油，使其体积分数分别为0，0.05%，0.1%，0.2%，24h 以及48h后用0.25%胰酶收集所有细胞，PBS洗 2次，弃上清，用100μL binding buffer重悬。加5μL AnnexinV，5μL PI，室温避光孵育 10min 后流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

2.4 实时定量PCR检测细胞内miR-21水平 

收集处于对数生长期的SPC-A1细胞，接种于12孔板，每孔细胞数5×105个，37℃，5% CO2培养箱中培养过夜，次日加入灵芝孢子油，使最终体积分数为0.1% ，同时设立空白对照组，于12h收集细胞，总RNA抽提按Trizol试剂(Invitrogen公司) 说明书进行，提取的总RNA 用紫外分光光度仪(Bio-Rad，USA)测A260。以U6 snRNA作为内参照，进行实时定量 PCR，反应条件参照FastStart Universal SYBR Green Master Rea1-Time PCR Quantitation Kit 提供的说明书操作，miR-21的相对表达水平用ΔCT和2－ΔΔCT计算。

2.5实时定量PCR检测PTEN和PDCD4 mRNA表达水平 

利用SYBR Green I染料检测SPC-A1细胞 中PTEN和PDCD4的mRNA，实验分组同前，各组细胞以5×105个/mL的密度接种于12孔板，次日加入灵芝孢子油，终体积分数为0.1% ，同时设立空白对照组，于12h收集细胞，总RNA 抽提按Trizol试剂说明书进行，提取的总RNA 用紫外分光光度仪测A260。总反应体积为25 μL，上、下游引物以及1 μL cDNA在95 ℃2 min变性后，共进行40个循环扩增，每个循环包括95℃30s，60℃30s，72℃30s，PTEN和 PDCD4的mRNA的相对表达水平用ΔCT和2－ ΔΔCT计算，GAPDH mRNA作为内参照。 

2.6 统计处理 

统计方法采用Graphpad Prism5软件进行处理，2组数据采用t检验，多组数据采用单因素方差分析。P＜0.05 为显著性差异。

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结果

3.1 灵芝孢子油抑制SPC-A1细胞增殖呈时间、浓度依赖性随着灵芝孢子油浓度以及时间的增加，SPC-A1细胞活力显著下降，细胞增殖抑制率显著升高，当灵芝孢子油为0.2%时，在48 h的细胞增殖抑制率达到80%左右(图1)。

3.2 灵芝孢子油对细胞形态的影响不同灵芝孢子油(0%，0.05%，0.1%，0.2%)作用SPC-A1细胞24h。随着灵芝孢子油浓度的增加细胞形态发生明显变化，在高浓度时细胞呈现整体萎缩，细胞膜边缘出现小气泡等典型细胞凋亡性状( 图2) 。

3.3 灵芝孢子油诱导SPC-A1细胞凋亡灵芝孢子油处理SPC-A1细胞24，48h，随着灵芝孢子油浓度的增加，SPC-A1 细胞早期凋亡率逐渐增大，呈现明显的剂量依赖性，而且48h的细胞早期凋亡率明显高于24h(图3)。

3.4灵芝孢子油下调miR-21，上调PTEN与 PD-CD4基因的表达0.1%灵芝孢子油在处理 SPC-A1细胞12h后，miR-21的表达被明显下调。而作为 miR-21靶基因的抑癌基因PTEN以及PDCD4 mR-NA的表达被显著上调。其中 PTEN上调表达10倍左右，PDCD4上调4倍左右(图4)。

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讨论

灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属的真菌，是 一种历史悠久的中药材。灵芝的主要活性成分包括多糖、三萜类、生物碱等，多篇文献报道其具 有降血糖、降血脂、抗肿瘤等功效［9］。已有 研究表明，灵芝孢子油的抗肿瘤机制包括: 通过调节免疫功能间接地抑制了肿瘤细胞的生长和增生，甚至杀伤肿瘤细胞［4］; 激 活 Caspase-3 从而引起细胞凋亡［5］; 抑制拓扑异构酶导致异常DNA结构的出现、染色体单体分离异常、复制叉受阻等，从而抑制细胞的增殖［3］。而本文 首次从miRNA调控细胞凋亡角度来探讨灵芝孢子油的抗肿瘤机制。

PTEN是具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活 性的抑癌基因，现已证实该基因的突变、失活与多种肿瘤的发生、发展密切相关，被称为是“后 p53时代的突变最多的肿瘤抑制基因”［10-11］。目前，许多研究显示PTEN基因缺失、突变或表达产物的失活，影响肺癌的发生、发展。PDCD4是一个新发现的肿瘤抑制因子，它可以与转录起始因子eIF4A和eIF4G相互作用来抑制一些促癌基因的翻译从而抑制TPA-诱导的致瘤性转化、肿瘤的发生和发展［12］。它在肺癌里面表达下调。此外，Jansen 等研究发现PDCD4 的表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［13］。 

本实验结果显示灵芝孢子油具有明显的抑制肿瘤细胞活力、促进肿瘤细胞凋亡的作用，这与以往研究结果类似。同时，致癌微小mRNA分子 miR-21被显著下调，这表明灵芝孢子油抗肿瘤作用与miR-21有关。为了进一步证明miR-21 分子的下调在灵芝孢子油抗肿瘤过程中发挥了重要作用，作者进一步检测其靶基因PTEN以及 PDCD4的表达。PTEN与PDCD4作为抑癌基因能够抑制肿瘤的发生发展、浸润和迁移［8，14］。 

综上，灵芝孢子油具有抑制肿瘤的作用，其机制与抑制miR-21表达从而提高抑癌基因 PTEN以及PDCD4表达有关。本研究为灵芝孢子油治疗肺癌提供了实验依据。

*文章内容节选自中国中药杂志第36卷第9期2011年5月

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