mmc检测到此管理单元发生一个错误_工艺分享 || 动物细胞培养基中硫酸葡聚糖的作用和残留检测...

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硫酸葡聚糖简介及作用

动物细胞在体外培养时，容易发生细胞结团现象。动物细胞间的粘附受到多种因素影响，如粘附受体的亲和状态改变，死细胞中释放DNA。工艺培养过程中分析细胞结团的原因来自两方面，一方面动物细胞本身可能存在固有的细胞结团现象，如CHOS细胞；另一方面动物细胞在遇到不良的营养条件和环境，也容易发生细胞聚集现象，以及培养基中Ca2⁺等离子的浓度也会影响细胞黏附。动物细胞发生粘附结团时，聚集团内部的细胞微环境会发生恶化，如氧气供应不足、代谢废物积累、营养物不足等，从而导致细胞死亡。抗细胞结团常采用的物质是多硫酸化合物，例如：肝素钠、硫酸乙酰肝素、苏拉明和硫酸葡聚糖。其原理是带负电荷的多硫酸化合物会改变细胞的表面电荷，从而维持单细胞形态培养。在多种多硫酸盐化合物中，硫酸葡聚糖是在CHO细胞悬浮培养中应用最广泛的抗结团剂。

硫酸葡聚糖是一种白色至灰白色的粉末，可溶于水，通常以钠盐的形式提供，其分子量范围在3-2000kDa。硫酸葡聚糖本身可以作为抗凝血剂、抗病毒药物和佐剂。硫酸葡聚糖本身具有一定的毒性，因此在纯化过程中需要去除硫酸葡聚糖，且对检测其残留水平，以确保其清除。

硫酸葡聚糖可以通过减少细胞聚集，促进CHO细胞生长、提高活率以及重组蛋白产量。研究发现硫酸葡聚糖也具有抗凋亡特性，可以延长发生自噬的CHO细胞存活。硫酸葡聚糖可以通过降低星形孢菌素诱导的线粒体跨膜电位的破坏，来防止星形孢菌素处理过的CHO细胞凋亡。此外，硫酸葡聚糖也能减少释放到细胞质中的细胞色素C的量，抑制caspase-9前体和caspase-3前体。硫酸葡聚糖通过线粒体途径抑制CHO细胞的凋亡，未涉及caspase-8的活化。硫酸葡聚糖的抗凋亡作用是非特异性的，因为硫酸葡聚糖可同时减少细胞色素C释放入细胞质和线粒体跨膜电位破坏。预测硫酸葡聚糖在典型的细胞培养条件下也可能显示抗凋亡作用，其中凋亡因素可以是氧化应激，渗透压应激，代谢副产物积累以及营养或生长因子耗竭。

不同分子量和浓度的硫酸葡聚糖的影响

2016年，科学家研究了硫酸葡聚糖的三种不同分子量(4000Da、15000Da和40000Da，其对应的S比例分别为3-6%、17-19%和15-19%)，以及不同浓度(0.1-1.0g/L)对两种不同重组CHO细胞(下文中SM-0.025为CHO-K1细胞；CS13-1.00为DG44细胞)细胞生长和单克隆抗体产量影响。并同时评估添加硫酸葡聚糖对单抗的关键质量属性(如聚体、电荷变化和N-糖基化等)的影响。

硫酸葡聚糖对细胞生长、活率和产量的影响

前期研究发现，采用200000Da的硫酸葡聚糖，无论使用哪种浓度(0.1-1.0g/L)，都会使最大活细胞密度和抗体浓度降低20-30％。说明采用200000Da的硫酸葡聚糖对细胞来说是有害。另外，对于不同分子量的硫酸葡聚糖，只要其浓度≥2g/L时，培养至第6天细胞活力都会降低到50％以下。

图1显示，对于SM-0.025细胞(CHOK1细胞)，对照组(添加0g/L 硫酸葡聚糖)在整个培养过程未发生细胞聚集现象，但培养后期会出现细胞生长和活力下降。添加不同分子量和浓度的硫酸葡聚糖后，虽然对培养前期细胞生长没有明显促进作用，但是均可以显著维持培养后期细胞密度和活力，从而延长其