作者：Shinya Inoue and Rudolf Oldenbourg
MICROSCOPES
1.术语表
f 焦距
M 放大率
n 折射率
NA 数值孔径
z 沿光轴的距离
λ 光波长
2.介绍
历史性概述
用光学显微镜产生有限差值、高度放大的图像所需的光学原理和基本镜头设计在一个世纪前就已经基本上完善了。恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)展示了为了解决特定的间距，必须捕获至少两个连续级别的dif破碎光(参见关于阿贝原理1的历史草图)。因此，他用漂亮的实验解释和证明了成像光的波长和物镜和聚光镜的数值孔径(NA，NA=nsinΘ，图1)对显微镜分辨率的影响。一般情况下，只能分辨的线栅的最小间距d不能小于
当聚光器的NA等于物镜的NA时。
随着Lister型物镜(图2a)的NA通过在Amici型物镜(图2b)中增加一个无光晕超半球来扩展，并且进一步通过加入均匀浸没(图2c)，物镜的数值孔径从0.25左右提高到0.65和1.25。消色差物镜(图2d)是在1986年引入的。
通过加入低色散萤石透镜元件，尽管存在二级光谱的残余误差和明显的视场曲率，但当与补偿目镜配合使用时，离色色对安娜的横向和纵向色差都有很好的校正效果，最高可达1.35%，但仍存在二级光谱的残余误差和明显的视场曲率。早期的高分辨率复合显微镜配备了一个(油浸式)阿贝聚光器，其虹膜隔膜放置在聚光器的前焦平面上，可以偏心实现倾斜照明。
光学显微镜的早期使用在很大程度上依赖于由于样品成分或结构的不同吸收、反射、双折射等可能产生的相对较高的图像对比度。未染色的活细胞和其他引入小光程差异的透明物体等样品通常不能直接进行显微镜观察，因为它们在精确聚焦时不会产生可检测到的图像对比度。
泽尼克消除了这些障碍，他展示了显微镜图像中的对比度是如何通过组成直射光线(没有被样品偏离)的光波和那些被散射的光波之间的干涉而产生的，这些光波因样品的存在而产生了相位差异。利用这一原理，泽尼克发明了相差显微镜。第一次能够聚焦地看到小的、不能吸收的物体的图像。Zernicke的发现，加上Gabor的进一步贡献，不仅为设计各种依赖干涉的成像设备提供了机会，更重要的是，提高了我们对显微镜成像所涉及的基本波动光学的理解。
与泽尼克的贡献差不多在同一时间，电子显微镜的完善使得将物体成像到纳米范围成为可能，尽管需要使用高真空环境和其他与电子成像兼容的条件。因此，在第二次世界大战后的40年里，光学显微镜在许多领域都退居次要地位，而不是电子显微镜。
然而，在过去的十年里，光学显微镜作为一种不可缺少的强大工具重新出现在许多应用领域，用于研究亚微米世界。在生物学和医学中，适当的标签，如荧光，特别是免疫荧光中心标签，被用来以异常高的灵敏度表示选定分子物种的存在和位置。远低于分辨率极限的物体的动态行为可由数字增强视频显微镜直接在其自然(例如。例如，水)环境。非常薄的光学切片可以用视频显微镜成像，用共焦光学效果更好。借助数字图像分析，可以快速进行定量测量。
与此同时，计算机芯片和相关的信息处理和存储设备，其可用性在一定程度上刺激了光学显微镜的新发展，它们本身也被微型化到微观尺寸，并以越来越高的密度封装。这些电子和光子设备反过来要求改进大规模制造和检查的手段，这两者都需要先进的显微镜光学。
在新需求的推动下，部分得益于计算机化的光线追踪和新光学材料的引入，我们今天看到了透镜设计质量的又一次划时代的进步。机械零部件的精度和遥控能力也在稳步提高。此外，随着改进的光电和机电设备的发展，在调节图像过滤、对比度产生方案以及使用显微镜光学对样品的光学操作方面，我们可以期待另一次突飞猛进的进展。
概要
在下面，我们首先回顾进入光学显微镜使用和设计的一般光学考虑因素，检查几种常用的对比度产生模式，讨论其他显微镜模式，列出显微镜用于光学操作样品的一些应用，并描述一些公认的机械标准。
在本手册的其他章节中更详细地讨论了这里在显微镜的背景下介绍的许多上述主题。关于一般光学方面的考虑，请参阅手册中关于几何光学(第一卷，第一章)和光学元件的章节，如透镜(第二卷，第一章)、反射镜(第二卷，第一章)、光学元件(第二卷，第一章)、镜片(第二卷，第一章)和光学元件(第二卷，第一章)。2)、偏光片(Vol.。二，伙计。3)等，以及关于波现象的物理光学的章节，例如干涉(第一卷，第二章)、DIF分数(第一卷，第三章)、相干(第一卷，第四章)和偏振(第一卷，第五章)，作为现象，这些现象对于显微镜的各种对比度模式的工作是必不可少的。有关图像检测和处理的材料可以在关于视觉、成像探测器和光学信息和图像处理的手册文章中找到。
有许多优秀的评论文章和书籍讨论光学显微镜的光学原理1、4、5和显微技术6-8及其应用。9-11本条款的部分目的是在显微镜制造商和用户之间架起一座桥梁，包括那些将显微镜光学装置安装到其他设备中或以非传统方式应用它们的人。因此，本文强调的是基本原理，并不试图讨论操作显微镜、特殊检查显微镜等专业仪器。
3.一般光学注意事项
几何和波光列，放大倍率
在常规显微镜(图3)的光学系统中，物镜Lob将样本O(或物体)的反转、真实、放大的图像O’投影到中间像平面(或主像面)中。
中间像面位于L后面固定距离f’+z’，其中f’是Lob的背焦距，z’是显微镜的光管长度。一般而言，O’是一幅航空图像，对于该图像，目镜Lob(或目镜)充当眼睛前面的放大镜。由于Lob与角膜表面和眼睛的晶状体结合在一起，在视网膜上产生O的直立图像O’’，物体对观察者来说看起来是倒着的。反过来，眼睛也可以用作投影仪。
继续图3中的示意图，使用薄透镜近似，O被放置在Lob的前焦距之外的短距离z处，使得z+f=a，其中f是Lob的前焦距，a是O和Lob之间的距离。O’在Lob后面的距离b=(z’ + f’)处形成。对于高度为O的y，图像高度y’=y*b/a。因此，Lob将O放大Mob= b/a。还有，Mob=f/z=z’/f’。Mob是Lob的横向放大率(或横向放大率)。反过来，y’被Loc放大一个系数Moc= 25 cm/foc，其中foc是眼睛的焦距，25 cm是所谓的距观察者眼睛的近距离(参见本手册中关于视力的章节)。因此，显微镜的总横向放大率Mtot=Mob*Moc。
请注意，大多数显微镜物镜都经过校正，只能在很小的成像距离范围内使用，而且通常只能与特定的眼镜组配合使用。M是刻在物镜镜筒上的放大率，定义为其指定的管长度(对于高倍物镜，Mob= z’/f)。在无限远校正物镜的情况下，Mob是与特定管透镜Ltb结合使用的比率y’/y(图4)。当显微镜物镜用作放大镜或反之用作高数值孔径缩小透镜时，必须记住这些因素，以及“显微镜镜头，像差”中提到的那些因素，以形成真正的差值分数限制的图像。在使用显微镜物镜作为放大镜头或反之用作高数值孔径缩小镜头时，必须牢记这些因素以及在“显微镜镜头，像差”一节中提到的那些因素。
共轭面
在透光显微镜中继续将光列返回到光源，图5a显示聚焦在样品中的轴上点上的波的射线路径和焦点。在科勒照明中，调整样品和聚光器之间的距离，使得照明器中的场光阑的图像与样品的聚焦区域重叠，并且调整灯收集器透镜，使得源图像聚焦在聚光器孔径光阑的平面上。在科勒照明中，调整样品和聚光器之间的距离，使得照明器中的场光阑的图像与样品的聚焦区域重叠，并且调整灯收集透镜，使得源图像聚焦在聚光器孔径光阑的平面上。因此，O、O、O’和O’'都位于彼此共轭的像平面中。
追踪光源中一点发出的光线(图5b)，光线在聚光器和物镜之间是平行的，因此样品被平面波前照射。这种情况的出现是因为聚光器的虹膜光圈内置于聚光器的前焦平面中。还有，既然是一个(有经验的)的瞳孔,观察者的眼睛被放置在眼点或眼睛的后焦平面，四个孔径平面L、L’、L’‘和L’’'再次彼此共轭。
图5根据科勒照明进行调整的透射光学显微镜中的光线路径。示出了两组共轭平面：(A)中的集合O与物体O并与场光阑平面共轭；(B)中的集合L与灯丝L并与孔径光阑平面共轭。
如检查这两个图所示，在整个光学系统中，场面和孔径面处于彼此相对的倒易空间中。这种倒数关系解释了不同的光圈和光圈如何影响照明和成像光线的锥角、路径和倾斜度，以及显微镜视场的亮度、均匀性和大小。更根本的是，为了理解显微镜成像的波动光学以及设计各种对比度产生装置和其他显微镜光学系统，需要彻底地掌握这些互易关系。
通风盘和横向分辨率
给定一个完美的物镜和驻留在样品平面中的无限小的光点，由物镜在中间像平面上形成的图像不是另一个无限小的点，而是具有有限扩展的差分式图像(图6a)。该艾里差分像是由物镜出瞳形成的夫琅和费差分图，球面波从该出瞳会聚到焦点。衍射图像(图6b)的辐照度分布由包含一阶贝塞尔函数J1(v)的表达式给出：
三维衍射图、轴向分辨率、焦深、景深
4.显微镜镜头，像差
物镜的名称和名称
覆盖层滑移校正
显微镜物镜校正的管长和管透镜
对于有限聚焦的“生物”物镜，大多数制造商已将机械管长度标准化为160毫米(见图37)。大多数制造商在其冶金系列中使用无限焦距(除了尼康使用有限的210 mm机械管长度)。Carl Zeiss、Carl Zeiss Jena、Reichert以及最近的徕卡和奥林巴斯都已将无限焦距用于生物和冶金目标。
对于无限焦物镜，从给定物点发出的光线在物镜和管透镜之间是平行的。由于物镜和管透镜之间的物理距离(Dp，图4)和光路长度并不重要，因此可以在不改变物镜校正的情况下将诸如补偿器、分析器和分束器之类的光学部件插入到该空间中。管透镜将平行光线聚焦到中间图像平面上。
无限焦物镜的放大率是通过将参考焦距除以物镜的焦距来计算的。表4列出了几家制造商采用的参考焦距。对于卡尔·蔡司的ICS(无限色彩校正系统光学)，参考焦距固定为160 mm(生物和金相)，用管状透镜校正物镜的残余色差。对于目前的Carl Zeiss Jena无限校正物镜(生物和金相)，物镜本身已完全校正横向和纵向色差，并使用不同焦距的管透镜来改变放大率。
工作距离
显微镜物镜通常设计成具有较短的自由工作距离，即。即从物镜的前部元件到盖子玻璃表面的距离，或者，在设计为无盖子玻璃使用的透镜的情况下，到样品表面的距离。然而，对于某些应用，长的自由工作距离是必不可少的，尽管实现大的数值孔径和所需的校正程度涉及到困难，但仍为这种用途设计了特殊的物镜。表5列出了一些提供超长工作距离的目标。
场大小，失真
显微镜中的视场直径由视场号或简称视场号表示，视场号是在中间图像平面中测量的场的直径(以毫米为单位)。对象平面中的场大小显然是场数除以对象的放大倍数。而字段编号通常受以下限制，除了眼睛的放大率和视场停止外，物镜的设计显然也有一个限制。在早期的显微镜物镜中，最大可用视野直径往往约为18 mm或相当小，但对于现代平面背色谱仪和其他特殊的平面场物镜，最大可用视野可达28 mm或更大。虽然可以从制造商处获得物镜的最大可用场数，但不幸的是，显微镜目录中并没有列出这些物镜的最大可用场数。认识到这些数字取决于与特定的显像管透镜和目镜的适当组合，我们应该鼓励将这些数据与例如紫外线透射特性(例如，例如，当传输波长降至50%或某些其他商定的分数时)。
现代显微物镜的设计
与早期的物镜不强调降低二次色差或视场曲率不同，现代显微镜物镜在大视场范围内校正这些误差往往是非常复杂的。在这里，我们将检查两个例子，第一个是尼康的60/1.40Plan Apochromat油浸式镜头(图12)
从物镜前端(图左侧)的超半球开始，这种无光差元件被设计成满足阿贝正弦条件，以最小化f轴球差和彗差，同时提供物镜总放大率的大约一半(图13)。在早期的设计中，为了最大化放大能力和最小化球面和色差，超半球的半径被设计得尽可能小，因为这些像差随着镜头焦距的增加而成比例地增加。然而，现代对更大的视场大小和更小的视场曲率的需求引入了一个相互冲突的要求，即需要保持尽可能大的半径，以便使超半球对Petzval和(正负曲率乘以透镜元件的折射率的代数和)的贡献最小化。这些Plan Apochros中的超半球是用高折射率、低色散的材料制成的，以补偿更大的半径。此外，在超半球的前表面产生负弯月面，在其上粘合一分钟的平凸透镜。超半球的负曲率导致了佩茨瓦尔和的减小。同时，微平凸透镜保护了耐候性较差的超半球材料。微平凸透镜和浸油之间的折射率匹配消除或最小化了透镜-油界面处的折射和反射，并提供了最大限度地将最重要的高NA光线透射到物镜中。折射率匹配还减小了该微小透镜元件的制造误差对物镜性能的影响。
位于浸油物镜前端的超半球的不平坦状态。前透镜的折射率与遮盖玻璃和浸渍油的折射率相同。非球面条件描述了折射率n、物体与球面的距离d和球面半径r之间的必然关系，以使从轴上某一点发出的光线在不引入球面的情况下折射后全部离开球面。在右边，显示了不同波长(C=656 nm，d=588 nm，F=486 nm，g=436 nm)的少量球差和偏离理想的超半球焦点。
无光晕超半球后面的低色散玻璃单线进一步减小了进入随后的双星的光线的锥角，使得这些透镜和随后的透镜能够集中精力校正轴向和侧向色差以及视场曲率。通过包含低色散正透镜元件和高色散负透镜元件，使用厚透镜元件，适当放置正和负透镜曲率，并通过广泛的光线追踪。在出射光瞳附近，降低通过凹面的光线路径的高度，以便产生使Petzval和最小的附加负值(以补充超半球中凹面所作的不足的负贡献)，从而可以在不过度降低物镜的放大率或增加其球差的情况下改善视场平坦度。
在现实中，客观作为一个整体的佩茨瓦尔和多少是负的，以补偿由眼睛贡献的不可避免的正佩茨瓦尔和。因此，中间像面处的图像，特别是现代物镜的矢状面上的图像，会向远离对象的方向鞠躬。除非成像区域相对较小，否则需要使用特定的望远镜才能获得最大的视场平坦度，否则就需要进行最佳校正。
与早期的物镜(图2a到2d)不同，早期物镜的设计在不同的制造商之间没有明显的差别，而现代显微镜物镜的设计可以有很大的不同。例如，比较上面讨论的尼康无铬60/1.4计划APO目标和图14中蔡司无限色彩校正系统63/1.4计划APO目标。这两种镜头都是最好的，都是最先进的。但是，除了一般的设计理念，包括决定避免或使用管状镜片来实现全色校正外，其他因素，如选择具有特殊色散特性的光学元件，紫外线透过率，无荧光，双折射，老化，透过率损失等，都会影响选择的安排。
虽然对现代研究级显微镜进行校正以防止像差将点源的图像扩散到艾里盘之外，但是由显微镜物镜形成的图像的几何失真往往不会得到很好的校正(例如，与相同图像角度下的摄影物镜相比)。因此，在生物使用的目标中，可能会出现高达1%的枕形扭曲。然而，在为半导体成像而设计的物镜中，失真可能低至0.1%，可以认为它们几乎没有失真。为了减少杂散光和耀斑，现代显微镜物镜包含带有精心调节的减反射膜的透镜元件，并且选择镜头曲率来最小化由多次反射引起的重影图像。
考虑到提供宽平视场、在宽波长范围内校正球面像差以及在高NA时校正低纵向像差和色像差的复杂设计，这些现代显微镜物镜的像差曲线不再是简单的三次曲线，而是转变为更高阶曲线的复杂组合(图15)。
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