二次扩增产物条带弥散_陈伟：体外等温核酸扩增辅助表面增强拉曼光谱用于超灵敏检测副溶血性弧菌...

病原微生物的检测对于公共健康和食品安全非常重要，传统方法很难满足对病原体检测灵敏度和特异性不断增长的需求。合肥工业大学陈伟教授团队采用副溶血性弧菌(Vp)作为模型分析物，开发了基于“抗体-Vp-适配体”异三聚体的表面增强拉曼散射(SERS)方法，结合体外等温扩增技术对副溶血性弧菌进行超灵敏检测。

原理如图1所示：先在96孔板上孵育上副溶血性弧菌的抗体，加入BSA阻止非特异性吸附，加入检测靶标Vp后抗体与之结合，然后加入含副溶血性弧菌适配体的ssDNA探针，同时作为RCA的引物，适配体与Vp结合形成“抗体-Vp-适配体”结构。接着加入RCA反应所需物质(环形模板、T4连接酶、phi29 DNA聚合酶)，经过等温RCA后加入Au@Ag标记的探针与RCA产物杂交结合，由于Au@Ag表面有R6G可输出拉曼检测信号，采用LabRAM HR Evolution进行SERS测量。

图1. 检测原理

 接下来通过琼脂糖凝胶电泳表征了RCA扩增结果，如图2a. b，泳道3表明了含适配体的ssDNA成功扩增出含有较大分子量的产物，泳道4表明了Au@Ag挂在了RCA产物上，有更大的分子量和空间位阻，导致更慢的迁移和较集中的条带。然后用TEM表征了Au@Ag是否挂在了RCA产物上，如图2c只有Au@Ag纳米粒子直径为20nm，比较分散，组装后(图2d)Au@Ag呈线性分散，直径达到微米级。接着，如图2所示，当没有靶标Vp时无拉曼信号(蓝线)，传统的测定方法拉曼信号为2.2*10^4 CFU/mL Vp(红线)，经过RCA扩增后，拉曼信号显著增强(黑线)。

图2.琼脂糖凝胶和TEM表征RCA扩增结果及拉曼放大结果

然后测定了随着Vp浓度增大，R6G在1651cm^-1处的拉曼特征峰也显著增加(图3)，特别的当Vp浓度仅有3CFU/mL时，与背景相比有较明显的区别。在3*10^8—2.2*10^8 CFU/mL有较好的线性范围，计算LOD值为1 CFU/mL，比其他检测方法好。在特异性检测中(图4)，只有在有Vp和其混合物的组中产生明显可见的拉曼响应。

图3. 检测不同浓度的副溶血性弧菌的拉曼信号结果及标准曲线

图4. 特异性检测

点评：

将这种“抗体+检测靶标+适配体”检测策略进行修饰可更广泛的应用于食源性检测，如用抗体识别特异性病原体靶标，用广谱性适配体探针检测更广范围的菌，如同一属的不同菌株。

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Yao L , Ye Y , Teng J , et al. In Vitro Isothermal NucleicAcid Amplification Assisted Surface-Enhanced Raman Spectroscopic forUltrasensitive Detection of Vibrio parahaemolyticus[J]. Analytical Chemistry,2017, 89(18):9775-9780.