Digital light processing-based 3D bioprinting and its applications in personalized medicine

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Digital light processing-based 3D bioprinting and its applications in personalized medicine

李婉露

3D生物打印

3D打印也被叫做增材制造，3D打印主要是基于数字化的三维模型，然后将三维模型转化成一些可以打印识别的文件传输到打印设备中，最后通过沉积的过程，形成三维结构。
在大尺寸物体的制作上，3D打印被应用于制作金属器械的部件。在精细物体的制作上，3D打印已经被用来制作精细的首饰。近些年，非常火热的研究是，用3D打印进行食物的特殊造型的构建。
3D生物打印，主要是在3D打印的基础上引入生物墨水。生物墨水主要是由材料和细胞构成。3D生物打印，也是基于三维的数字模型，利用一些特殊的打印设备，对生物的活性材料，还有一些生物活性分子，以及活性细胞在空间内进行精确的的排布。

3D生物打印的主要流程

3D bioprinting of tissues and organs
典型的3D生物打印的主要流程为：成像-方法设计-材料选择-细胞选择-生物打印-应用。
首先，它需要获得一个打印模型，模型往往是基于医学影像文件，在数字处理以后获得的一个三维模型。
其次，需要选取生物墨水。生物墨水，主要分为生物材料和细胞两部分。对于生物材料的选择，主要是一些合成的聚合物和天然的水泥胶类的物质。此外，还有一些研究是用细胞外基质作为生物材料。关于生物材料的选择，需要基于研究目的。比如，研究需要进行特定组织的模拟，就需要考虑组织对细胞外基质的特异性要求。另外，也需要结合不同材料对于不同打印方法的适配性，然后进行材料的筛选。对于细胞的选择，主要是已经成熟分化好的组织特异性细胞。近年来，由于干细胞，特别是诱导性多能干细胞（IPSC）的飞速发展，也开始将诱导性多能干细胞应用到3D生物打印当中。
接着，根据打印文件和生物墨水，就可以选取相应的打印设备。需要根据研究的目标进行打印设备的选取。有的需要构建较大尺寸的组织，有的需要构建精密的组织。就需要据此选择相应的设备。
最后，打印出来的三维结构可以被用在后续的应用当中。应用主要分为两部分。一部分是作为组织器官的替代，然后进行损伤后的组织修复。另一部分，是构建体外的疾病模型，进行后续的药物筛选或者药物开发的研究。

3D生物打印的常用方法

3D bioprinting of functional tissue models for personalized drug screening and in vitro disease modeling
目前常用的3D生物打印方法，主要分为4类。第一类，喷墨式的3D生物打印。原理和喷墨打印机类似，呈点状喷出材料，实现点状的生物材料沉积。第二类，基于挤出式的打印方法。生物墨水通过喷头挤出，完成线状的沉积。第三类和第四类是基于光的3D生物打印。第三类，数字光处理打印方法（DLP），用光学元件DMD把一系列二维的打印图像投射在生物墨水上，通过逐层的光固化，最后得到三维结构。第四类，基于双光子的打印。因为精度很高，常用于加工光敏感树脂，进行一些比较精细的医疗器械的打印。
Digital Light Processing Based Three-dimensional Printing for Medical Applications
挤出式打印方法的设备比较简单，已经有很多成型的商用设备可以采用，所以相关研究较多。但是该方法要求生物墨水的粘度不能太低。其现状成形的方式也导致打印速度较慢。受限于喷头的尺寸，也不具备很好的打印精度。部分研究显示，挤出打印过程中的剪切应力会影响部分细胞在打印之后的活性。
数字光处理打印方法对于材料的适用性比较好。其基于面的逐层打印方法使它具有快速的打印速度。其打印精度主要取决于DMD元件像素的精度，理论上可达6微米。对细胞也有比较好的兼容性。这些优势使得它能更好地打印出组织器官的类似结构。
DLP近年来被广泛的使用在生物医学的研究领域。DLP的快速发展不仅取决于该打印体系的发展，还取决于材料科学和打印设备的优化。DLP在生物医学工程领域主要应用在两个方面。
一方面，构建组织类似物，然后进行在体的修复和替代。另一方面，可以构建病变组织模型或者体外器官模型，进行后续的药物毒性检测或者筛选。

智能手机支持的打印

A Smartphone-Enabled Portable Digital Light Processing 3D Printer
用智能手机驱动的小型投影仪来替代传统的大型光学设备，再通过智能手机进行远程操纵。投影仪投射出来的图案通过镜面反射，投射在生物墨水槽上，通过内容的移动就可以面面固化，形成三维的结构。
该平台可以较好地打印出物体表面的细节，可以打印出多孔、中空和螺旋式的复杂管道结构。这表明，该打印平台可以被用来构建一些血管模型。
该平台特别适合在资源有限的环境中进行使用，比如急救或者战地医学环境当中。在这类环境中，骨损伤非常常见。利用该平台设计了一种骨的模拟物，移植到骨缺损位置的时候，也观察到了比较好的匹配度。另一方面，原位生物打印也是生物打印发展的一个趋势。其可以避免打印好的物体在转移以及手术过程中受到污染，同时可以更好的跟组织缺损进行整合。利用该平台也成功的实现了肌肉缺损处的补充。该平台可以充分利用智能手机中一些已有的成熟软件，比如三维扫描软件。利用这种软件，只需通过拍照就能形成复杂的三维文件，继而用来进行3D生物打印。这也避免了对三维打印文件设计的专业技能的要求。

可组合梯度的生物打印

Digital Light Processing Based Bioprinting with Composable Gradients
要构建一个体外的组织模型，仅仅有宏观的形态是远远不够的。组织都是存在于组织特异性的微环境当中。首先要考虑的就是组织内的梯度特征，包括生长因子梯度、细胞种类或者是细胞分布密度梯度。梯度对于组织器官的发生，正常生理状态的模拟，以及疾病的发展都是至关重要的。但是在之前的研究当中，受限于打印设备，梯度往往难以实现。因为生物打印都是基于同一种生物墨水完成的，因此很难在单次打印中实现多材料，或者梯度的模拟。通过生物墨水槽的更换实现多材料打印会消耗非常多的时间，操作也比较复杂。
引入微流体混合器。通过控制进口处不同液体组分的流速来调解出口液体的梯度。研究中采用的被动混合器，可以很好的在比较短的流道上快速实现液体的混合。
单次混合大约在一分钟内完成。把微流体混合器末端集合的墨水槽整合至DLP打印机的墨水槽的位置，就可以实现对梯度的打印。主要的打印过程是，生物墨水的灌注，光固化，生物墨水的真空吸出，生物墨水的灌注……这样的循环。过程快速，墨水用量小。
通过该平台，可以构建复杂的二维颜色梯度变化，还可以构建三维的在垂直方向的颜色梯度变化。通过对模型进行不同组分的分割，可以实现模型从离散到连续的一系列垂直和水平方向的颜色梯度变化。
该平台可用于细胞密度梯度或组织功能性梯度的构建。能够在单次打印中精确的，可预测的调控生物墨水的梯度变化。利用该平台构建了内部肿瘤细胞多，外部肿瘤细胞少的细胞密度梯度。构建了血管内皮细胞的梯度分布。构建了血管生长因子（VEGF）梯度变化的支架，将支架移植到这个鸡胚当中，通过分析生成的血管，发现生成的血管密度与VEGF梯度呈正相关。 将该平台应用在骨支架构建的研究当中，将骨的孔隙结构和成骨生长因子（BMP-2）两部分梯度同时构建在支架当中。一方面，构建了孔隙率的梯度变化，来模拟骨在结构上的特征。另一方面，构建了成骨生长因子的梯度，用来诱导打印后的间充质干细胞（MSC）的成骨分化。4周之后，MSC成骨分化标志物跟BMP-2的梯度呈正相关的。该平台为之后用来构建其他复杂组织中，微环境的梯度提供了可能。

可裂解生物墨水用于软组织生物打印

Molecularly cleavable bioinks facilitate high-performance digital light processing-based bioprinting of functional volumetric soft tissues
组织的硬度也是决定组织功能和细胞活性的非常关键的因素。不同组织的硬度有非常大的差异。打印既能模拟组织的复杂功能，又同时具备组织特异性硬度的组织模拟物是比较困难的。因为能够带来比较高的结构稳定性的生物材料往往无法支持细胞很好的存活增殖和功能表达，即结构的稳定性和细胞的活性是两个难以兼顾的性质。
通过分子裂解的方法，将打印后的生物材料可选择的断裂其中一种，实现整体硬度的降低。研究中采用了常用的两种生物材料，GelMA和HAMA。这两种材料在打印之后，能形成比较密实的水泥胶结构。打印之后，采用HAMA的特异性酶Hase来裂解HAMA这个组分来降低结构的硬度。通过调控Hase的浓度和处理时间，可以获得一系列从心脏到肺、肝、脑这种较软组织的力学性能的模拟。在硬度匹配的结构中，组织特异性的细胞具有更好的存活增殖和功能表达。
通过Hase进行酶解，获得在不同酶解的条件下，广泛分布的一个硬度图谱。图谱体现了该方法可以实现从软到硬，所有组织硬度的覆盖。通过这个方法，可以模拟脑皮层的沟回结构，肝小叶结构，肺泡结构，心房心室结构。在保证打印结构复杂性的前提下，通过酶的处理，将不同的打印结构处理到与目标组织相匹配的硬度。
在研究中，利用神经干细胞进行打印。打印之后，通过酶处理达到的硬度匹配的结构中，神经干细胞的增殖、生长和分化更好。分化出的神经元具有功能性的突触蛋白表达和电活动。
力学传导（Mechanotransduction）通路，包括Rap1和Hippo都有涉及。
进行了肝小叶结构的打印。打印了肝脏细胞系，肝脏细胞可以表达与代谢相关的物质。酶解之后，硬度更匹配真实肝脏的时候，肝脏细胞有更好的代谢表达。进行了肺泡结构的打印。打印了肺部的成纤维细胞，在这种肺泡结构当中成纤维细胞具有更好的细胞生长。

展望

生物在体打印能够进行比较深层的缺损组织的修复。目前的打印技术是无法实现的，主要是局限于光的穿透深度以及光引发剂的限制。
细胞作为生物3D打印的一个核心。之前的研究大多都在使用比较成熟的组织细胞，很难获得组织相应的细胞异质性。目前IPSC的发展就为改善这个问题提供了一些可能。IPSC可以特异性的分化诱导成病人特异性的细胞。因此在体外的疾病模型构建以及药物筛选当中，它是有非常好的应用前景的。针对这种个性化的精准治疗，是一个非常好的细胞来源。