【Regulatory Genomics】Part1基因调控的生物学基础、motifs与测序技术

来自Manolis Kellis教授（MIT计算生物学主任）的课
油管链接：Regulatory Genomics - Deep Learning in Life Sciences - Lecture 07 (Spring 2021)
本节课分为三个部分，本篇笔记是第一部分。
本节探讨基因调控的生物学基础、DNA motifs以及用于探测基因调控的关键技术（CHIP-seq、DNase-seq以及ATAC-seq）。主要是为后面的内容打下基础，为深度学习所用的数据进行说明

• 课程大纲

Biological foundations of gene regulation

1. DNA甲基化:

   • 原因: DNA甲基化是直接作用于DNA分子的一种修饰。当某些胞嘧啶（C）位点被添加上一个甲基团时，它们就被称为被甲基化了。
   • 机制: DNA甲基化通常会导致基因的沉默，因为这种修饰阻止了转录因子和其他蛋白质与DNA结合。此外，甲基化的DNA会吸引某些蛋白质（如甲基化DNA结合蛋白），这些蛋白质可以进一步改变染色质的结构，使其更为紧凑。
   • 功能: DNA甲基化在许多生物过程中起到关键作用，如基因沉默、X染色体失活、创伤应激反应和癌症。

2. 组蛋白修饰:

   • 原因: 组蛋白修饰是在组蛋白的特定氨基酸残基上发生的化学变化。例如，赖氨酸上可以添加甲基、乙酰或磷酸化团等。
   • 机制: 组蛋白修饰可以改变染色质的紧凑度，从而影响DNA的可及性。例如，某些组蛋白修饰可以使染色质更为放松，促进基因的表达，而其他修饰则导致染色质更为紧凑，抑制基因的表达。
   • 功能: 组蛋白修饰在基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期调控等多种过程中都发挥着重要作用。

在使用ChromHMM或类似的方法进行染色质状态分析时，染色质状态被视为隐藏状态，而实际的表观遗传标记（例如组蛋白修饰）被视为观察到的数据。

隐马尔可夫模型（HMM）的工作方式是，基于观察到的数据（在这里是各种表观遗传标记）来推断最有可能的隐藏状态序列（在这里是染色质状态）。因为染色质状态本身不能直接测量，所以需要通过这种统计方法来推断它。

例如，如果一个基因区域有H3K4me3和H3K27ac的组蛋白修饰，但没有H3K27me3，那么HMM可能会推断这个区域是一个活跃的启动子。这种推断是基于已知的关于这些修饰与基因活性之间的关系。

DNA motifs

1. DNA结合结构域：这是转录因子中的一个区域，能够特异性地与DNA中的特定序列结合。
2. 识别特定序列：展示了三种不同的转录因子（TF1、TF2和TF3）如何识别和结合到特定的DNA序列上。例如，TF1与TAATTA序列结合，TF2与CACGTG结合，而TF3与AGATAAGA结合。

1. 蛋白质“感觉”DNA：

   • 蛋白质可以“读取”DNA碱基的化学特性。
   • 蛋白质并不打开DNA（不需要碱基互补性来与DNA结合）。

2. 3D拓扑结构决定特异性：

   • 完全受限位置：在这里，每一个原子的位置都很关键。这意味着蛋白质与DNA的结合是非常精确的，每一个原子的位置都有其特定的功能。
   • “模糊/退化”位置：这些位置的接触是松散的，不需要完全匹配。这意味着在这些位置，蛋白质与DNA的结合有一定的灵活性。

3. 其他类型的识别：

   • MicroRNAs：这是一种小的非编码RNA，其识别原理是基于碱基的互补性。
   • 核小体：它们的识别与GC含量有关。GC含量是指DNA序列中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分比。某些核小体更倾向于与GC含量较高的区域结合。
   • RNA结构和组合：这里提到RNA的结构和组合也可以影响与其他分子的识别和结合。

Technologies for probing gene regulation

CHIP-seq

b站视频

ChIP-seq（染色质免疫沉淀后续测序），这是一种用于确定DNA中某特定蛋白质（例如转录因子或组蛋白修饰）绑定位置的技术。

1. 样本制备：首先，细胞内的DNA和与其结合的蛋白质通过形式化物固定，这样可以保持其相互作用。

2. Lysing/Sonication：细胞裂解，随后通过超声波破碎DNA，形成较小的片段。

3. Immunoprecipitation (IP)：使用特定的抗体来沉淀目标蛋白质及其结合的DNA。这里展示了与非组蛋白结合（Non-histone ChIP）和与组蛋白结合（Histone ChIP）的情况。

4. DNA提纯：将绑定的DNA从蛋白质中分离出来。

5. End Repair & Adaptor Ligation：修复DNA的末端并连接一个适配器，以便于下一步的扩增。

6. PolyA tailing：添加PolyA尾，有助于下一步的测序。

7. 扩增和测序：

   • Amplification on beads (emulsion PCR)：在微珠上进行扩增，使得每个珠子上只有一个DNA模板。
   • Cluster generation (bridge PCR)：在Illumina测序平台上，形成簇或集群，每个簇由同一个模板扩增的多个DNA片段组成。
   • 下面部分展示了不同的测序技术，包括Illumina、Roche Pyrosequencing、ABI以及Helicos等。

8. Bar-coded multiplexed sequencing：使用带有不同条形码的适配器，使得多个样本可以在同一个通道上进行测序，之后再通过条形码进行区分。

9. 数据分析：最后，得到的测序读数被解析并分析，以确定目标蛋白质在基因组中的结合位置。图中展示了四种不同的蛋白质（Input, Pol II, Ste12, Cse4）的结合位置，这可以帮助研究者了解这些蛋白质如何调控基因的表达。

DNase-seq

DNase-seq是一种用于鉴定基因组中开放染色质区域的技术。开放染色质区域通常与基因的转录活性相关，并可能包含转录因子结合位点。

以下是DNase-seq的主要步骤：

1. 染色质状态：在最上方，我们看到了细胞核中的染色质。染色质由DNA和与之关联的蛋白质（例如组蛋白）组成。在这里，染色质中的某些区域（由黄色线表示）是开放的，而其他区域是紧密结合的。

2. DNase-I消化：将细胞暴露于DNA酶I (DNase-I) 下。DNase-I是一种可以切割双链DNA的酶，特别在开放的染色质区域活跃。消化的程度取决于DNase-I的浓度和暴露时间。

3. 收集DNA：经DNase-I处理后的DNA片段被收集起来。然后，通过大小选择方法，通常选择长度在100-300bp之间的DNA片段。

4. 测序：收集的DNA片段被进行高通量测序，如图中所示。这可以产生大量（例如，60-100M）的测序读数。

5. DNase-seq读数计数：最终，测序读数被映射回参考基因组。这生成了一个图谱，表示开放染色质区域的位置和强度。在这里，高的峰代表了高度开放的染色质区域，可能是转录因子结合位点或其他调控元件。

ATAC-seq

测序测定染色质可及性

ATAC-seq是一种用于鉴定基因组中开放染色质区域的技术，它能够快速、高效地为细胞提供转录调控信息。

以下是ATAC-seq的主要步骤：

1. 染色质状态：左边表示紧密打包的、转录非活跃的染色质。右边表示松散打包的、转录活跃的染色质。后者的染色质区域更为“开放”，更易于转录因子和其他蛋白质访问。

2. 超活跃转座酶：使用超活跃的转座酶结合适配器DNA对细胞进行处理。转座酶能够同时对DNA进行断裂和标记。

3. 同时的DNA断裂和标记：在松散打包的、转录活跃的染色质中，超活跃的转座酶将适配器DNA插入到开放的染色质区域。

4. 纯化和PCR扩增：然后从细胞中纯化出已标记的DNA片段，并使用与适配器序列相对应的标签进行PCR扩增。

5. 下一代测序：利用下一代测序技术对扩增的DNA片段进行测序。得到的测序读数反映了细胞中开放染色质的位置。

6. ATAC-Seq峰值：最终，使用测序数据在基因组上鉴定开放染色质的区域。这些区域在图上显示为“峰值”，每个峰代表一个开放染色质的位置。