+ `--classified-out <classified_output>`输出分类结果到指定文件。
+ `<input_reads>`是你的输入测序数据文件。
-
宿主去除和病毒序列提取:
- 分析Kraken2的输出报告和分类结果,识别出被分类为宿主的reads并从原始数据中去除。
- 提取被分类为病毒的reads,这些就是初步鉴定的病毒序列。
使用Centrifuge进行宿主去除和病毒序列鉴定:
-
数据准备:
- 同样确保你已经获得了原始的测序数据。
-
数据库准备:
- 下载或构建包含宿主和病毒参考序列的Centrifuge数据库。可以使用
centrifuge-build
命令构建数据库:
centrifuge-build --name <database_name> --ref <reference_directory> --seq <sequence_file>
其中
<reference_directory>
包含fasta格式的参考序列文件,<sequence_file>
是一个包含序列名称和分类信息的tsv文件。 - 下载或构建包含宿主和病毒参考序列的Centrifuge数据库。可以使用
-
运行Centrifuge:
- 使用以下命令对测序数据进行分类和鉴定:
centrifuge -x <database_name> -1 <input_reads_1> [-2 <input_reads_2>] -o <output_prefix> --report-file <output_report> --threads <num_threads>
其中:
+-x <database_name>
指定使用的数据库。
+-1 <input_reads_1>
和-2 <input_reads_2>
分别指定单端或双端测序数据文件。
+-o <output_prefix>
指定输出文件的前缀。
+--report-file <output_report>
生成分类报告。
+--threads <num_threads>
设置并行线程数。 -
宿主去除和病毒序列提取:
- 分析Centrifuge的输出报告,识别出被分类为宿主的reads并从原始数据中去除。
- 提取被分类为病毒的reads,这些就是初步鉴定的病毒序列。
病毒预测
使用VirSorter进行嵌段式和整合式病毒的预测。
首先,确保你已经安装了VirSorter和其依赖软件(如Python、BLAST+、Prodigal等)。以下是在Linux环境下使用VirSorter的基本步骤:
-
数据准备:
- 确保你已经获得了微生物基因组的fasta文件。
-
下载和安装VirSorter:
- 从GitHub上克隆VirSorter的代码库:
git clone https://github.com/jiarong/VirSorter.git cd VirSorter
-
配置环境:
- 确保你的环境中已经安装了BLAST+和Prodigal。如果没有,可以按照以下命令安装:
conda install -c bioconda blast prodigal
-
运行VirSorter:
- 使用以下命令运行VirSorter:
python virsorter.py -i <input_genome_file> -o <output_directory> --db <database_directory>
其中:
+-i <input_genome_file>
指定输入的微生物基因组fasta文件。
+-o <output_directory>
指定输出结果的目录。
+--db <database_directory>
指定VirSorter数据库的目录。如果你还没有下载数据库,可以使用以下命令下载并解压:
wget http://huttenhower.sph.harvard.edu/virsorter/db_virsorter.tar.gz tar -xzf db_virsorter.tar.gz
-
分析结果:
- VirSorter会在输出目录下生成多个文件,包括分类结果、注释信息和可视化图谱。
- 分析
virsorter_output/candidate_viral_proteins.faa
和virsorter_output/summary.txt
文件,可以获取到预测的嵌段式和整合式病毒的信息。
以下是使用VirSorter的一个完整示例脚本:
# 下载并安装VirSorter
git clone https://github.com/jiarong/VirSorter.git
cd VirSorter
# 安装依赖软件
conda install -c bioconda blast prodigal
# 下载VirSorter数据库
wget http://huttenhower.sph.harvard.edu/virsorter/db_virsorter.tar.gz
tar -xzf db_virsorter.tar.gz
# 运行VirSorter
python virsorter.py -i input_genome.fasta -o output_directory --db db_virsorter
# 分析结果
less output_directory/virsorter_output/summary.txt
在这个脚本中,你需要将input_genome.fasta
替换为你的微生物基因组fasta文件的路径,将output_directory
替换为你希望保存输出结果的目录。运行这个脚本后,你可以在output_directory/virsorter_output
目录下找到预测的结果。
3. 病毒分类注释
使用BLAST对比NCBI病毒数据库进行分类注释(fasta文件较大的话推荐先prodigal然后使用蛋白序列使用diamond做序列比对diamond大基因序列快速比对工具使用详解-包含超算集群多节点计算使用方法_diamond比对-CSDN博客)。
makeblastdb -in virus_database.fasta -dbtype nucl
blastn -query assembled_contigs.fa -db virus_database.fasta -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -num_threads $THREADS -evalue 1e-5 > blast_results.txt
或者使用ViPhOG (Viral Phage Orthologous Groups) 进行更精细的分类。
ViPhOG (Viral Phage Orthologous Groups) 是一个专门用于病毒和噬菌体蛋白质分类的系统。以下是如何使用ViPhOG进行更精细的分类:
-
获取ViPhOG数据库和工具:
- 访问ViPhOG的GitHub页面(https://github.com/bebatut/viphog)并下载最新的ViPhOG数据库和相关的Python脚本。
-
安装依赖库:
- 确保你的系统已经安装了Python和以下依赖库:
- Biopython
- HMMER
- Diamond
- CD-HIT如果尚未安装,你可以使用以下命令进行安装(假设你已经安装了conda环境管理器):
- 确保你的系统已经安装了Python和以下依赖库:
conda install -c bioconda biopython hmmer diamond cd-hit
-
准备蛋白质序列文件:
- 将你需要分类的蛋白质序列整理成一个或多个人工 fasta 文件。
-
运行ViPhOG分类:
- 使用以下命令运行ViPhOG分类脚本:
python viphog.py -i your_protein_sequences.fasta -d ViPhOG_database_directory -o output_directory
其中:
* `-i your_protein_sequences.fasta` 是你的蛋白质序列文件。
* `-d ViPhOG_database_directory` 是ViPhOG数据库的目录。
* `-o output_directory` 是输出结果的目录。
-
分析结果:
- 分类完成后,ViPhOG会在指定的输出目录下生成多个文件,包括比对结果、分类信息等。
- 主要关注
output_directory/viphog_assignments.txt
文件,其中包含了每个蛋白质序列的ViPhOG分类信息。
-
解读分类信息:
- ViPhOG分类信息是以数字编码的形式表示的,每个数字代表一个特定的蛋白质家族或功能类别。
- 你可以通过查阅ViPhOG数据库中的描述文件来解析这些数字编码,了解每个分类的具体含义。
4. 病毒功能注释
使用InterProScan进行蛋白质结构域和功能注释。
-
安装InterProScan:
- 如果你还没有安装InterProScan,可以从其官方网站(https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html)下载并按照提供的说明进行安装。
-
准备蛋白质序列文件:
- 将你需要进行注释的病毒蛋白质序列整理成一个或多个人工fasta文件。
-
运行InterProScan:
- 使用以下命令运行InterProScan:
interproscan.sh -i your_protein_sequences.fasta -f tsv -dp -goterms -pa -o interpro_results.tsv
其中:
* `-i your_protein_sequences.fasta` 是你的蛋白质序列文件。
* `-f tsv` 指定输出格式为TSV(制表符分隔值),便于后续的数据处理和分析。
* `-dp` 启用深度搜索模式,以提高注释的覆盖率。
* `-goterms` 启用Gene Ontology (GO) 术语注释。
* `-pa` 使用并行处理以加速注释过程(需要根据你的系统配置调整并行线程数)。
* `-o interpro_results.tsv` 指定输出结果的文件名。
-
分析结果:
- InterProScan运行完成后,会在指定的输出文件(在这个例子中是
interpro_results.tsv
)中提供详细的蛋白质结构域和功能注释信息。 - 这个文件通常包含以下列:
protein_name
: 蛋白质名称或标识符。sequence_length
: 蛋白质序列的长度。signature_library_match
: 结构域或功能注释所基于的数据库或签名库。signature_acc
: 结构域或功能注释的唯一标识符。signature_desc
: 结构域或功能注释的描述。start
: 结构域在蛋白质序列中的起始位置。end
: 结构域在蛋白质序列中的结束位置。score
: 结构域匹配的得分(如果适用)。status
: 结构域匹配的状态(例如,"T"表示确定的匹配,"C"表示条件性的匹配)。go_terms
: 相关的GO术语(如果可用)。
- InterProScan运行完成后,会在指定的输出文件(在这个例子中是
-
解读和可视化结果:
- 使用文本编辑器或数据处理工具(如Excel、R、Python等)打开和分析
interpro_results.tsv
文件。 - 根据需要筛选和汇总结果,例如按病毒种类、结构域类型或GO术语分类。
- 可以使用专门的可视化工具(如Cytoscape、GSEA或定制的脚本)将结果可视化,以帮助理解蛋白质的功能分布和网络。
- 使用文本编辑器或数据处理工具(如Excel、R、Python等)打开和分析
或者使用 eggNOG-mapper 对比 eggNOG 数据库进行功能注释。
-
安装 eggNOG-mapper:
- 如果你还没有安装 eggNOG-mapper,可以从 GitHub(https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper) 下载并按照提供的说明进行安装。
-
下载 eggNOG 数据库:
- 访问 eggNOG 网站(http://eggnogdb.embl.de/version/latest/download/)下载最新的 eggNOG 数据库。
- 解压下载的数据库文件,并记住解压后的目录路径。
-
准备蛋白质序列文件:
- 将你需要进行功能注释的病毒蛋白质序列整理成一个或多个人工fasta文件。
-
运行 eggNOG-mapper:
- 使用以下命令运行 eggNOG-mapper:
emapper.py -i your_protein_sequences.fasta --output outdir --cpu 4 --mode s --Diamond blastp --orthologs best --evalue 1e-5 --annotation cut_ga --evolutionary-distance 0.7 --search-tool diamond --database eggNOG_database_directory
其中:
* `-i your_protein_sequences.fasta` 是你的蛋白质序列文件。
* `--output outdir` 指定输出结果的目录。
* `--cpu 4` 设置使用的CPU核心数(根据你的系统配置调整)。
* `--mode s` 选择快速搜索模式(适用于大规模数据集)。
* `--Diamond blastp` 使用Diamond进行蛋白质比对。
* `--orthologs best` 只保留最佳的同源群注释。
* `--evalue 1e-5` 设置Diamond比对的E-value阈值。
* `--annotation cut_ga` 启用GO和EC编号的注释。
* `--evolutionary-distance 0.7` 设置进化距离阈值。
* `--search-tool diamond` 指定使用Diamond作为搜索工具。
* `--database eggNOG_database_directory` 指定eggNOG数据库的目录。
-
分析结果:
- eggNOG-mapper运行完成后,会在指定的输出目录(在这个例子中是
outdir
)中提供详细的蛋白质功能注释信息。 - 这个目录通常包含以下文件:
emapper.annotations
:包含每个蛋白质的详细注释信息,包括同源群、GO术语、EC编号等。emapper.best_hits.tsv
:包含每个蛋白质的最佳同源群注释。emapper.results.all_contigs.tsv
:包含所有比对结果的汇总信息。
- eggNOG-mapper运行完成后,会在指定的输出目录(在这个例子中是
-
解读和可视化结果:
- 使用文本编辑器或数据处理工具(如Excel、R、Python等)打开和分析
emapper.annotations
文件。 - 根据需要筛选和汇总结果,例如按病毒种类、GO术语或EC编号分类。
- 可以使用专门的可视化工具(如Cytoscape、 REVIGO、定制的脚本)将结果可视化,以帮助理解蛋白质的功能分布和网络。
- 使用文本编辑器或数据处理工具(如Excel、R、Python等)打开和分析
5. 病毒丰度和多样性分析
使用Bracken对Kraken2的结果进行校正,得到更准确的病毒丰度。
bracken -k viral_classification.kraken2 -o bracken_output -t $THREADS -c contig_lengths.txt
使用UCHIME或vFam进行嵌段式病毒的去冗余。
使用UCHIME进行去冗余:
UCHIME主要用于检测和去除PCR和测序过程中的假阳性序列(如chimeras)。虽然它最初设计用于16S rRNA基因的分析,但也可以应用于其他类型的序列,包括病毒序列。以下是一个基本的UCHIME命令行示例:
usearch -uchime_ref query_sequences.fasta -db reference_sequences.fasta -strand both -uchimeout uchime_output.uc
这里:
query_sequences.fasta
是你的待去冗余的病毒序列文件。reference_sequences.fasta
是你的参考序列文件,可以包含已知的病毒序列或其他相关序列。-strand both
表示在正反两条链上都进行去冗余分析。-uchimeout uchime_output.uc
指定输出结果的文件名。
UCHIME将生成一个.uc
格式的输出文件,其中包含了可能的chimeric序列的信息。你可以根据这些信息进一步过滤或去除潜在的冗余序列。
使用vFam进行去冗余:
vFam是一个专门针对病毒家族进行分类和去冗余的工具。它基于HMM(Hidden Markov Model)模型,可以识别和分类病毒序列。以下是一个基本的vFam命令行示例:
vfam classify --input query_sequences.fasta --output classified_sequences.fasta --hmms_dir vfam_hmms_directory
这里:
query_sequences.fasta
是你的待去冗余的病毒序列文件。classified_sequences.fasta
是输出的分类和去冗余后的序列文件。vfam_hmms_directory
是包含vFam HMM模型的目录。
vFam将对输入的序列进行分类,并将结果写入到classified_sequences.fasta
文件中。在这个过程中,vFam会自动去除冗余的序列。
使用Alpha diversity和Beta diversity指标(如Chao1、Shannon指数、UniFrac等)进行病毒群落多样性的分析。
Alpha多样性分析:
Alpha多样性主要关注单一样本内的物种丰富度和均匀度。以下是一些常用的Alpha多样性指数及其计算方法:
-
Chao1指数:
- Chao1指数是一种估计样品中未观测到的物种数目的方法,反映了物种丰富度。
- 在R语言中,可以使用
vegan
包中的estimateR
函数计算Chao1指数。
-
Shannon指数:
- Shannon指数考虑了物种丰富度和相对丰度,反映了物种多样性。
- 在R语言中,可以使用
vegan
包中的diversity
函数计算Shannon指数。
Chao1:对于基于病毒序列的数据,你可能需要先将数据转换为OTU(Operational Taxonomic Unit)表或者物种丰度矩阵,然后才能使用estimateR
函数。以下是一个基本的示例:
library(vegan)
# 假设你已经有了一个OTU计数矩阵otu_table,其中行是样本,列是OTUs
# 并且你已经有了一个样本分类信息的数据框sample_data
# 计算Chao1指数
chao1 <- estimateR(otu_table, method = "chao1")
# 将结果与样本分类信息合并
alpha_diversity <- cbind(sample_data, Chao1 = chao1)
在这个例子中,otu_table
是一个矩阵,其中每个元素表示对应样本中特定OTU的数量。estimateR
函数的method
参数设置为"chao1",以指示计算Chao1指数。
然而,如果你的数据是原始的病毒序列数据,你可能需要先进行一些预处理步骤,例如:
- 序列聚类:将相似的序列聚类为OTUs。
- 计算OTU丰度:统计每个样本中每个OTU的数量。
这些步骤通常可以通过使用其他生物信息学工具或R包(如DECIPHER
、cluster
等)来完成。一旦你得到了OTU计数矩阵,就可以使用estimateR
函数计算Chao1指数了。
Shannon指数以下是一个基本的R代码示例:
library(vegan)
# 假设你已经有了一个OTU计数矩阵otu_table,其中行是样本,列是OTUs
# 并且你已经有了一个样本分类信息的数据框sample_data
# 计算Chao1指数
chao1 <- estimateR(otu_table, method = "chao1")
# 计算Shannon指数
shannon <- diversity(otu_table, index = "shannon")
# 将结果与样本分类信息合并
alpha_diversity <- cbind(sample_data, Chao1 = chao1, Shannon = shannon)
Beta多样性分析:
Beta多样性主要关注不同样本间的物种组成差异。以下是一些常用的Beta多样性指标及其计算方法:
- UniFrac距离:
- UniFrac距离考虑了物种之间的进化关系,可以用来比较不同样本间的群落结构差异。
- 在R语言中,可以使用
picrust
或phyloseq
包中的函数计算UniFrac距离。
以下是一个基本的R代码示例(使用phyloseq
包):
library(phyloseq)
# 假设你已经有了一个包含OTU表、样本信息和树状图的phyloseq对象ps
# 计算UniFrac距离
unifrac_dist <- phyloseq::distance(ps, "unifrac")
# 进行PCoA分析以可视化样本间的Beta多样性差异
pcoa_unifrac <- ordinate(ps, method = "PCoA", distance = unifrac_dist)
# 绘制PCoA图
plot(pcoa_unifrac, type = "n")
points(pcoa_unifrac, col = sample_data$Sample_Group, pch = 16)
在进行病毒群落多样性的分析时,需要注意以下几点:
- 病毒的分类和系统发育信息可能不如微生物清晰,这可能影响到Alpha和Beta多样性指标的解释和应用。
- 病毒的复制和传播方式可能与微生物不同,因此在选择和解释多样性指标时需要考虑到这些特性。
- 在处理病毒序列数据时,可能需要进行额外的质量控制和预处理步骤,如去除宿主序列、过滤低质量序列等。
6. 病毒网络分析和热点区域识别
使用VIPER或VIPRA构建病毒互作网络。
使用VIPER构建病毒互作网络:
VIPER (Virus-Host Interaction Prediction Engine) 是一个基于机器学习的工具,用于预测病毒与宿主之间的蛋白质相互作用。
-
数据准备:
- 准备病毒蛋白和宿主蛋白的氨基酸序列文件。
-
安装和运行VIPER:
- VIPER提供了一个用户友好的Web界面(https://viperdb.scripps.edu/),可以直接在线进行分析。
- 在VIPER网站上,上传你的病毒蛋白和宿主蛋白的fasta文件。
- 设置参数,如预测方法、置信度阈值等。
- 点击提交按钮,VIPER将进行预测并生成一个互作网络。
-
分析结果:
- VIPER会返回一个互作网络,其中包括病毒蛋白和宿主蛋白之间的预测相互作用。
- 可以下载结果,并使用网络分析工具(如Cytoscape)进行可视化和进一步分析。
使用VIPRA构建病毒互作网络:
VIPRA (Virus-Host Protein-Protein Interaction Prediction and Ranking Algorithm) 是一个基于深度学习的工具,用于预测和排名病毒与宿主之间的蛋白质相互作用。
-
数据准备:
- 准备病毒蛋白和宿主蛋白的氨基酸序列文件。
-
安装和运行VIPRA:
- VIPRA是一个命令行工具,需要在本地安装和运行。
- 下载VIPRA源代码并按照提供的说明进行安装。
- 使用以下命令运行VIPRA:
vipra predict --virus_proteins virus_proteins.fasta --host_proteins host_proteins.fasta --output output_file.txt
其中:
* `--virus_proteins` 指定病毒蛋白的fasta文件。
* `--host_proteins` 指定宿主蛋白的fasta文件。
* `--output` 指定输出结果的文件名。
-
分析结果:
- VIPRA会生成一个文本文件,其中包含了病毒蛋白和宿主蛋白之间的预测相互作用及其得分。
- 可以将这些相互作用数据导入到网络分析工具(如Cytoscape)中,构建和可视化互作网络。
为了做好运维面试路上的助攻手,特整理了上百道 【运维技术栈面试题集锦】 ,让你面试不慌心不跳,高薪offer怀里抱!
这次整理的面试题,小到shell、MySQL,大到K8s等云原生技术栈,不仅适合运维新人入行面试需要,还适用于想提升进阶跳槽加薪的运维朋友。
本份面试集锦涵盖了
- 174 道运维工程师面试题
- 128道k8s面试题
- 108道shell脚本面试题
- 200道Linux面试题
- 51道docker面试题
- 35道Jenkis面试题
- 78道MongoDB面试题
- 17道ansible面试题
- 60道dubbo面试题
- 53道kafka面试
- 18道mysql面试题
- 40道nginx面试题
- 77道redis面试题
- 28道zookeeper
总计 1000+ 道面试题, 内容 又全含金量又高
- 174道运维工程师面试题
1、什么是运维?
2、在工作中,运维人员经常需要跟运营人员打交道,请问运营人员是做什么工作的?
3、现在给你三百台服务器,你怎么对他们进行管理?
4、简述raid0 raid1raid5二种工作模式的工作原理及特点
5、LVS、Nginx、HAproxy有什么区别?工作中你怎么选择?
6、Squid、Varinsh和Nginx有什么区别,工作中你怎么选择?
7、Tomcat和Resin有什么区别,工作中你怎么选择?
8、什么是中间件?什么是jdk?
9、讲述一下Tomcat8005、8009、8080三个端口的含义?
10、什么叫CDN?
11、什么叫网站灰度发布?
12、简述DNS进行域名解析的过程?
13、RabbitMQ是什么东西?
14、讲一下Keepalived的工作原理?
15、讲述一下LVS三种模式的工作过程?
16、mysql的innodb如何定位锁问题,mysql如何减少主从复制延迟?
17、如何重置mysql root密码?
网上学习资料一大堆,但如果学到的知识不成体系,遇到问题时只是浅尝辄止,不再深入研究,那么很难做到真正的技术提升。
一个人可以走的很快,但一群人才能走的更远!不论你是正从事IT行业的老鸟或是对IT行业感兴趣的新人,都欢迎加入我们的的圈子(技术交流、学习资源、职场吐槽、大厂内推、面试辅导),让我们一起学习成长!
?
6、Squid、Varinsh和Nginx有什么区别,工作中你怎么选择?
7、Tomcat和Resin有什么区别,工作中你怎么选择?
8、什么是中间件?什么是jdk?
9、讲述一下Tomcat8005、8009、8080三个端口的含义?
10、什么叫CDN?
11、什么叫网站灰度发布?
12、简述DNS进行域名解析的过程?
13、RabbitMQ是什么东西?
14、讲一下Keepalived的工作原理?
15、讲述一下LVS三种模式的工作过程?
16、mysql的innodb如何定位锁问题,mysql如何减少主从复制延迟?
17、如何重置mysql root密码?
网上学习资料一大堆,但如果学到的知识不成体系,遇到问题时只是浅尝辄止,不再深入研究,那么很难做到真正的技术提升。
一个人可以走的很快,但一群人才能走的更远!不论你是正从事IT行业的老鸟或是对IT行业感兴趣的新人,都欢迎加入我们的的圈子(技术交流、学习资源、职场吐槽、大厂内推、面试辅导),让我们一起学习成长!