敲除(KO)细胞qPCR验证总失败？最新引物设计思路拆解

当你拿到一株敲除细胞时，是否会烦恼如何验证其敲除效率或是否敲除成功呢？看完本文，不用进行步骤繁琐且结果不稳定的WB，只需动动小手设计个引物，就可以轻松得到结果。

一．引物设计思路

根据不同的基因型情况：

①杂合子或纯合子

设计思路：一条引物建议落在被敲除的序列上，另外一条引物落在外显子上；

qPCR结果说明：通常纯合子CT值大于35，则可认为敲除成功；杂合子2^-(∆∆Ct)值一般<1（基因拷贝数不同，存在二倍体及多倍体等情况）；

例：两条引物一般选择跨外显子（除编辑外显子较大外）

②移码

设计思路：一条引物3’端最后一个或多个碱基需落在编辑序列上，另外一条引物落在外显子上；

例：

a.单个碱基

b.多个碱基

③点突变

设计思路：与移码相似，一条引物3’端最后一个碱基落在突变位置，另外一条引物落在外显子上；

例：

注意：

1.若编辑细胞的基因型为移码（单个碱基敲除或敲入）或单个碱基发生点突变，虽然引物3’末端碱基错配会大大降低taq酶的延伸速率，但仍然会发生错配延伸，产生非特异性扩增产物，这对结果判断会造成影响，一般建议做WB实验从蛋白表达层面进行验证敲除效果；

2.以上引物都需遵循“二．引物设计原则”。

二．引物设计原则

1.特异性

引物扩增为目标特异产物（大小控制在100~300nt之间），引物特异性如何进行比对，可回顾“干货|NCBI引物设计保姆级教程”一文；

2.引物长度

一般在18~30 nt之间，引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)，且不适于聚合酶进行反应，会影响到PCR扩增效率；

3.GC含量&TM值

GC含量控制在40%~60%之间，过高或过低都不利于聚合酶引发反应；另外正反向引物GC含量应相近，这样可避免两者Tm值和退火温度差异较大；

Tm值应尽量在55~65℃之间，一般为60℃左右，上下游的Tm值应尽量接近，最好不超过4℃。

4.引物双端碱基注意点

①引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大差异，当末位碱基为A时，在错配的情况下，也能引发链合成，导致产生非特异性扩增产物（溶解曲线会呈现双峰或多个峰图）,因此需避免3′端末端为A；

②若为探针引物，则其5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G碱基也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现；

5.碱基分布及引物互补情况

①引物中四种碱基的分布最好是随机的，3′端避免超过3个连续的G或C，3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区发生配对，导致产生非特异性扩增产物；

②引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠形成发夹结构，而影响引物与模板的退火时的复性结合效率；

③两条引物之间不能有连续4个碱基的互补，产生的引物二聚体会降低PCR效率，甚至影响定量准确性；

6.避开复杂二级结构

扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行，设计引物时尽量避开该区域设计引物；可利用mfold/UNAFold等工具，对产物DNA序列进行二级结构的预测。