土壤基因组dna提取试剂盒

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土壤中的微生物资源非常丰富，原核生物细胞含量大约1×10^7个／g，但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01％~10％，且大部分微生物处于不可培养的状态，使相当多的菌种不能被充分地开发和利用。

由于土壤微生物成分复杂，常规提取总DNA的方法难以去除腐殖酸，而微量的腐殖酸便可抑制PCR扩增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反应的限制性内切酶活性。另外，土壤质地和成分的差异也会影响土壤微生物DNA的提取效果．

土壤DNA提取的一般方法学浅析

国外学者对不同的土壤DNA提取和纯化方法进行了比较研究，现行土壤微生物基因组DNA提取方法可分为直接法和间接法2类，直接法采用原位裂解土壤微生物提取DNA(一般采用直接法），间接法采用速差离心回收菌体，裂解菌体提取DNA．间接法会大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组（宏基因组），目前已经很少研究者会采用这种方法，所以以下将围绕直接法进行展开。

SDS的高盐提取法

取lg上壤，枷入2·7mLDNA提取液，2卑L蛋白酶K225r/min、37振荡30min，加入0.3mL20%SDS，65度水浴（每隔15～20min轻轻颠倒几下），离心取沉淀加入0.9mLDNA提取液和0.1mL20%SDS,涡旋10s，65度水浴10min，离心收集上清，重复上述操作两次，合并上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL无菌水溶解。

Eichner调整法

取lg上壤，加入lmLPBS、0.5mL溶菌酶、20μL蛋白酶K。37度水浴2h，加溶液Ⅰ（5mol/LNaCl,10%CTAB) 100μL，65度水浴10min，离心去沉淀，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL用100μL无菌水溶解。

Kuske修订法

取1g上壤，加入2mL TENS混合，70度水浴1h，每隔15~20min轻轻颠倒几下，离心留上清，沉淀用1.5mL TEN洗一次，离心取沉淀加1.5mL TEN,混匀，混匀，反复冻融3次，离心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用无菌水溶解．

Edgcomb改进法

取lg上壤，加入2mL PBS，225r／min、37度振荡30min,离心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ（0.15mol/LNaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL 溶菌酶，37度水浴1.5h，加入5mol/L NaCI 270μL、溶于0.7mol/LNaCl的5mol/LCTAB270μL，水浴后加入2mL溶液Ⅱ（0.1mol/L NaCl,0.5mol/L Tris，10%SDS), 65度水浴10min，反复冻融3次，离心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL无菌水溶解．

Tsai报道的方法

取lg上加入2mL PBS，225r/min，37度振荡3min，离心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ（0.15mol/L NaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL溶菌酶，37度水浴2h后加入2mL正溶液II（0.15mol/L NaCl,0.5mol/L EDTA，10%SDS)反复冻融3次,离心取上清,酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用无菌水溶解．

高压灭菌法

取lg土壤，加lmL TE(l(10mM Tris.lmM EDTA、pH8.0），密封于灭菌的离心管中，离心管放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件为：121度、1min，然后快速放气降压，离心取上清，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用100μL无菌水溶解．

综上，通过实际操作发现，以上几种土壤DNA提取方法普遍存在DNA得率低，或者DNA得率难于控制等问题。土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA得率降低。

鉴于以上问题，MP BIO公司开发出Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒，为目前土壤DNA快速高效提取提供了一种新选择。

土壤DNA快速高效提取方法

MP BIO Fast土壤DNA快速提取

Fast DNA Spin Kit for Soil 可以在 30 分钟内快速有效地从土壤等环境样本中直接提 取基因组 DNA。配合 MP FastPrep 仪器使用，可在 40 秒内破碎动植物组织，细菌，藻类， 真菌孢子，以及土壤等环境样本中的其它组成。

Fast土壤DNA快速提取操作步骤：

1. 在裂解介质管 E 中最多加入 500mg 土壤样品；

（注意：推荐最多加入 500mg 土壤样品，含水量比较多的土壤或者碎屑多的土壤可适量减少样品量。）

2. 在裂解介质管 E 中加入 978μl Sodium Phosphate Buffer；

3. 加入 122μl MT Buffer；

（注意：为了得到更好的样品处理效果，加入土壤样品及两个缓冲液后，在裂解介质管中 仍能保留有 250-500μl 空间。）

发生的反应：用洗涤剂溶解细胞膜蛋白以及细胞外蛋白和土壤中的污染物。

4. 将样品置于 FastPrep 仪器上匀浆 40s，速度为 6.0m/s；

发生的反应：机械破碎土壤微生物的细胞壁，将核酸释放入保护缓冲液中。

5. 14,000 x g 离心 5-10min 至沉渣；

注意：如果把离心时间延长到 15min，可以更好地使样品量较大的，或者细胞壁结构较 复杂的细胞碎片沉降到管底 。

6. 将上清液转移至一个干净的 2.0ml 离心管中。加入 250μL 的 PPS 溶液（蛋白质沉淀溶 液），用手颠倒 10 次，使之充分混合；发生的反应：将溶解的核酸与细胞沉渣以及裂解介质分离。产生絮状蛋白。

7. 14,000 x g 离心 5min 至沉淀。将上清液转移至一个干净的 15ml 管中。注意：此步也可使用 2.0ml 离心管，但使用大管可以更好的混匀以及 DNA 的结合；

发生的反应：去除絮状蛋白。

8. 重悬 Binding Matrix 溶液，将 1.0 ml 重悬液加入该 15ml 管中；

9. 用摇床或手动颠倒混匀 2min，使 DNA 更好的与 Binding Matrix 结合。之后将管子置于 管架上，静置 3min，使 Binding Matrix 自然沉降；

发生的反应：在离液盐存在的情况下，核酸与 Binding Matrix 结合。

10. 小心地去除 500μl 上清液，避免吸到沉淀下来的 Binding Matrix；

11. 用剩余的上清液轻轻的重悬 binding matrix，转移大约 600μl 的重悬液至 SPIN Filter 中，14,000 x g 离心 1min，弃去收集管中的废液。将 15ml 管中剩余的重悬液转移到 SPIN Filter 中，再次离心弃去废液；

12. 加入 500μl 预先准备好的 SEWS-M 溶液，用枪头轻轻吹打，小心地重悬沉淀；

注意：使用前确保 SEWS-M 溶液中已加入乙醇。在 SEWS-M 溶液中加入 100ml 100% 的乙醇，混匀。在瓶子上做好标记，密闭储存于室温。

发生的反应：继续溶解蛋白。

13. 14,000 x g 离心 1min，弃去废液；

发生的反应：通过离心过滤，用脱盐的乙醇和去垢剂去除杂质，而 DNA 仍然与 Binding Matrix 结合。

14. 不加任何溶液，将 SPIN Filter 14,000 x g 离心 2min，去除残留的 SEWS-M 溶液。弃去收集管，更换一个新的、干净的离心管；

15. 将 SPIN Filter 置于室温，晾干 5min；

发生的反应：去除残留的乙醇。

16. 在 SPIN Filter 中加入 50-100μl 的 DES 溶液（或者无菌/无 DNA 酶的水），轻轻的 重悬 Binding Matrix。注意：a：为了避免过度稀释纯化出的 DNA，请尽量减少 DES 溶液的量 b：55C 水浴孵育 5min 能提高纯化产物的得率 ；

发生的反应：低盐洗脱液使 Binding Matrix 和 DNA 再水合化，导致盐桥断裂，从而使 纯化的核酸从 binding matrix 中洗脱下来。

17. 14,000 x g 离心 1min，使洗脱的 DNA 转移至收集管中。弃去 SPIN Filter。得到的 DNA 纯化产物可直接用于 PCR 及其它下游实验。使用前可储存于 4℃，长期保存可置 于-20℃；

发生的反应：最后纯化的 DNA 可通过过滤柱，收集至一个新的离心管中。

MP BIO 土壤DNA提取试剂盒方法学评估

方案优势：

瞬间完全裂解环境生物学样品中的任何微生物；

获得的DNA直接用于定性或定量分析；

去除腐殖酸和PCR抑制剂，方便微生物多样性研究；

不同实验之间优异的重复性。

应用前景：

微生态学；

海洋生物资源开发；

宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有十分重要的应用前景；

环境保护和污染修复；

生物酶制剂开发。

参考文献：

[1]EicherC A,Erb R W,TimmisKN，et al。Appl Environ Microbial [J].1996，620(10):3787-3793；

[2]Christense B,Fink J.Merrifield R B,et al.Proc Natl Acad USA[J].1998，85(14):5072-5076。