CRISPR/Cas9的实验操作流程

一般流程：

1.根据你要研究的基因设计sgRNA（chopchop或crispr.mit)，并根据你现有的载体选择合适的Cas9种类：

2.合成sgRNA后连入你的sgRNA表达载体，一般备选2-3个，以便测试效率；

3.根据你的位点相关信息，在sgRNA切口处选择长度40bp左右（方便引物合成)的同源重组臂序列，需要左右两侧都有；

4.根据你们实验室现有的一些细胞载体，找到有neo和puro标签的载体，找出序列，设计引物扩增出这两种抗生素标签片段；

5.公司合成带有同源重组臂的抗生素扩增片段，以步骤4的片段为模板，扩增出带有同源重组臂的标签片段；

6.共转染Cas9质粒、sgRNA质粒和两个标签片段，48小时后药筛，第一轮药筛用neo，筛选5天后加入puro进行双抗筛选，删选出同时拥有neo和puro抗性的基因敲除细胞；

7.对获得的细胞进行单克隆鉴定，选出在你要研究的基因位点发生双等位基因编辑的细胞株。

全部实验时间如果足够幸运可以压缩在一个半月，CRISPR是很平民的技术，不用怕，敢想敢干就能有回报。

经典案例：

2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因(肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R)突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。

CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶(ZFN)、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。

CRISPR/Cas9所需材料

1）质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。 pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。 pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。 上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。

2） 超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)

3） 高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4） Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一般检测。

5） QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)

6） QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)

7） Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014)，如需要将sgRNA构建到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。

8） T7 DNA ligase with 2× rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者 T4 DNA ligase，二者无区别。

9） Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)

10）dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)

11） MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)

12） T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)

13） Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)

14） Adenosine 5′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S)

15）SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)

CRISPR/Cas9操作过程

1)确定target site。 根据CRISPR在线设计工具http://crispr.mit.edu/设计sgRNA，（还有其他设计工具，推荐该软件）。将目的基因250bp以内的核苷酸序列输入，避免内含子，约10min将会给出备选的target site。 或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为target site，一般target site可选在正义链或者反义链，二者均可。

2) 准备sgRNA表达体系。 三种方案可选：

a, 直接使用PCR扩增纯化产物，该产物片段含有U6+sgRNA，约370bp；

b, 将sgRNA载体构建到 pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中，即单载体系统；

c, sgRNA载体构建到构

3)建到pUC19当中，成为双载体系统。

a.PCR扩增sgRNA表达结构。

PCR体系如下： U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC U6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAcNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段) 其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。

PCR反应条件如下： 该程序固定，不推荐更改。

PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分。 条带位置为370bp。

PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收。

b. 构建sgRNA载体—单载体系统（pSpCas9(BB)-2A-GFP）。 首先，按照前述方法target site确定，根据target site设计需插入的sgRNA Oligo。

一般来说，sgRNA oligo的形式如下：

sgRNA top: CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNN sgRNA bottom: AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 两条设计好的oligo需经磷酸化，退火成双链，其体系如下： 程序如下： 37 °C 30 min; 95 °C 5 min; 每分钟降5 °C 至25 °C。 结束后按照1：200加水稀释（1ul oligo+199 H2O） 其次，将合成好的sgRNA oligo插入到目的载体中， 本实验将使用pSpCas9(BB)-2A-GFP。其连接反应体系如下： 其中pSpCas9(BB)-2A-GFP 100ng, 根据浓度调整体积。

连接1hr。 设计对照，对照同上，只是不加oligo。

连接反应条件如下： 连接反应结束后，推荐使用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基，该步骤可选，但强烈建议该步操作。 37 °C 30 min, 70 °C 30 min。之后保存到-20°C，可保存至少一周。

该步骤结束后的产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用Stbl3感受态。采取热击的方法：取2ul PlasmidSafe后的质粒，加入到20ul感受态中，冰上10min，热击42 °C，30 s，立即置于冰上2min，加入100ul SOC，直接涂板。使用含有Amp100的LB平板。37°C过夜。 第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的板中长有克隆。 挑取单克隆摇菌，用QIAprep spin miniprep kit进行质粒提取。用U6-Fwd primer做为测序引物测序。

c． sgRNA双载体表达系统（构建到pUC19中） 若利用pUC19建立双载体表达系统，首先依旧是参照之前的方法，寻找target site，设计引物用于扩增U6+sgRNA scafford；Fwd引物需含EcoRI，Rev引物需含HindIII 酶切位点。之后进行酶切连接等操作。 酶切体系如下： U6+sgRNA PCR产物酶切 pUC19质粒酶切 酶切产物纯化，使用QIAQuick PCR purification kit，纯化后可-20 °C保存。 连接：酶切后的质粒与PCR产物按照1：3，室温连接15min。 连接反应结束后，推荐用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基。（可选做） 后续转化大肠杆菌，热击转化，涂板，挑单菌落，摇菌，提质粒，测序检测。

当然，如果大家还有问题可以在接下来的2021年3月2日的直播间来一起讨论哦！