淋巴细胞、悬浮细胞分离进展及方法学评估

hi~大家好，我是三三，2020年12月24日，平安夜，愿我们生科的伙伴们平平安安、快快乐乐！2020的最后几天，假如将即将逝去的 2020 视作一篇论文，那么你该怎么为你的这篇大作加关键词呢？我想，大概我们中很多人必然不会少的是“疫情、抗疫”等词。

最近，来自英国的超强变种更是让世界变得更紧张起来。作为地球人，在这巨大的疫情阴霾下，新冠疫苗或许成了很多人眼中最后的救命稻草了吧！

当然，话说回来，所谓没有对比就没有伤害！还是很庆幸我们都生活在这片可爱的土地，起码我们还可以顺利地工作，还可以无忧地学习，不紧不慢地做着自己喜欢的事情，畅想着未来的美好！那么，让我们继续努力充实自己吧！

今天三三将和大家一起来探讨的是和疫苗相关的“T细胞”。提到T细胞的大名，大伙肯定是比较熟悉的了，作为免疫细胞家族赫赫战将，T细胞的相关应用可谓是百花齐放了！比如，PD-1/PD-L1抑制剂、CAR-T疗法、疫苗、单抗等。当然，吃水不忘挖井人，我觉得还是有必要先认识一下第一个把T细胞带给我们的人—Jacques Miller、Max D.Cooper。

1961年在伊丽莎·霍尔医学研究所Jacques Miller在实验中发现，切除胸腺之后的小鼠不会对来自另一品系的小鼠的皮肤产生排异反应，由此证明了排异反应相关的免疫细胞形成于胸腺，这也是最早关于T细胞形成的记录。但他的实验并没有得到广泛的接受，直到1965年1月，儿科医生和免疫学家Max D.Cooper等才利用大量的临床观察才正式证明了T细胞、B细胞的存在，并将成果发布在《自然》期刊上。

无论是B细胞还是T细胞的发现无疑是历史性的，因为它们的发现不仅揭示了免疫学的重要谜团，并且为众多药物和疫苗的研发奠定了基础。事实上，过去50年来免疫领域的所有基本发现都可以追溯到Max D.Cooper和Jacques Miller的开创性工作。他们历史性的发现还推动了治疗新策略的产生——利用免疫细胞及其产物来对抗癌症、自身免疫病、免疫缺陷病等众多疾病。可以说，Jacques Miller、Max D.Cooper的发现为现代免疫学打开了大门。

然而，就两人这样历史性的发现，相对于发现了同是免疫家族一员吞噬细胞的梅契尼科夫而言是不幸的。Jacques Miller、Max D.Cooper并没有获得诺贝尔奖的青睐。更别说，2018年诺贝尔生理学或医学奖还颁给了癌症的免疫治疗方向，而这种治疗的原理正是通过释放被癌细胞抑制的T细胞功能，来达到治疗癌症的目的。

虽然未获得诺贝尔奖，但可以肯定的是T细胞等的发现绝对可以称之为历史性的重大发现。在过去几十年里，各种诸如PD-1/PD-L1抑制剂、CAR-T疗法、抑或是最近大家比较重视的新冠疫苗研发等，T细胞的相关免疫学应用研究可谓越来越热。大量且大广度地应用必然意味着T细胞的基础性研究必然要越来越成熟，比如建立可支持T细胞体外发育的培养体系，稳定而高效地分离出高纯度且活性不受影响的T细胞等。三三查阅了一些相关文献后发现，关于T细胞的培养分离技术除了大家比较熟悉的磁珠分离法外，还有亲和板结合分离法上花结形成分离法、补体介坤的细胞毒分离法、尼龙橇分离法、磁珠分离法和流式细胞术分离法等方法。为了方便大家在实际的实验实践研究中选择性使用，下面对几种方法进行对比说明：

方法学	描述	应用
亲和板结合分离法	直接法：用特异性抗体包被塑料平皿或培养板，表达特定膜抗原的细饱即与相应抗体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细胞，改变缓冲液的离子强度，将结合在板上的细胞解离，获得目的细胞。	简捷、经济；可同时进行细胞阳、阴性分选；收获量大；亲和板上细胞分离损伤；抗原抗体结合后可导致相应细胞被活化。
	间接法：用第二抗体包被平皿．将预先与特异性单抗结合的淋巴细胞与之反应后，可吸附于平皿上·从而达到分离的目的。
E花结形成分离法	E花结形成主要取决于细胞间受体配基的二维亲和力和密度，Long等在此基础上建立了一个概率模型．通过这个模型半定量地判定受体与配体间的亲和力大小，从而可以作为评估人体内免疫状态的参考。	检测分析细胞的免疫水平和动态的变化
补体介导的细胞毒分离法	l.ympho-kwik试剂是一种类似鸡尾酒的混合试剂，含有单克隆抗体和补体，在与将要分选的细胞混合后，能形成密度梯度通过抗体．抗原复合物活化补体去除B细胞和单核细胞达到分离T细胞的目的	会激活和杀伤被抗体结合的细胞；适用于阴选分离法，去除非目的细胞。
尼龙毛分离法	T 细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对 B 细胞的亲和力，从而使 T 细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。	分离纯度不高；回收率低；现作为对细胞悬液初步纯化的一种辅助手段，即在分选T细胞前用尼龙棉去除B细胞。
磁珠分离法	用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4+细胞或CD8+T细胞的自动分离	仪器小巧，消毒方便，不需要专人操作，实验流程对细胞损伤小，有极好的回收率和存活率，分选细胞的有效方法
流式细胞术分离法	四聚体技术能定量抗原特异性T细胞，通过置换四体复合物中的肽，可以检测不同表位的T细胞。	室温等外界条件，数据处理要求较高。流式细胞仪及其抗体都较昂贵。
其他	李付广等报道了细胞培养淘汰筛选法，该法是利用细胞在特定的培养基中死亡的时间不同而筛选纯化出T细胞，	纯度小，现应用较少

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