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细胞转染的方法主要包括：人工脂质体法、磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、电穿孔法、病毒转导法等，上期详解了细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和步骤 等，今天做个细胞转染技术大比拼，了解各种细胞转染的方法优缺点，再根据自己的实验要求选择理想的方法，获得漂亮的实验结果。
接下来，详述一下几种经典细胞转染的方法。
一、人工脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞，转染效率高、重复型好，但转染时需要去除血清，转染效果随细胞类型变化大。
脂质体转染的原理与步骤：
二、磷酸钙法
通常穿了“隐身衣”核酸分子在“照妖镜”磷酸钙的作用下可形成“肉眼可见”的磷酸钙-DNA共沉淀，可使共沉淀中浓缩DNA分子与细胞表面结合并通过内吞作用进入细胞。该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感，所得结果容易出现差异，且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性，转染效率较差。
三、DEAE-右旋糖苷法
常言道：同性相斥，异性相吸。因而，当带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸中带负电的磷酸骨架相遇，妥妥的火花四射，而后会被细胞膜抱团相拥并通过细胞内吞作用迎客到家。该法可用于瞬时转染，操作相对简单、结果可重复，但是对细胞有一定的毒副作用，且转染时需要血清。
四、电穿孔法
有时，细胞有些“油盐不进”，就是不开放门户给核酸放行，此时各位小伙伴可采用一些强硬手段—电穿孔法。此法利用高脉冲电压破坏细胞膜电位，使得DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定/瞬时性转染，适用于所有类型的细胞，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，且需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。
其他物理基因输送法还包括基因枪、直接显微注射等方式。前者又称为粒子轰击，可将包裹着核酸的显微重金属颗粒告诉射入受体细胞内，适用于瞬时性转染。该技术可需要昂贵的设备，且细胞死亡率较高。而后者则是通过精细的注射针将核酸送入胞浆中，一次只能输送一个细胞中，适用于构建转基因动物或输送人工染色体。
五、病毒转导法
一般，病毒介导的转染也称之为转导，它为难以转染的细胞类型提供了一种方法，可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中，可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。
技术应用案例：
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，即原德国Amaxa 4D-Nucleofector核转系统，结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过系统内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。
Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中，其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂，可加快基因表达，已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞，多数细胞系转染效率可高达50-70%，部分原代细胞转染效率可超过90%。目前，LONZA 4D-Nucleofector已大量应用于CAR-T细胞的研究中。
图.用Nucleofector细胞核转染系统，将GFP标记的质粒转染新生儿皮肤成纤维细胞（NHDF-neo），2小时后用3.5% PFA 固定，共聚焦显微镜可观察到GFP蛋白在细胞核内表达。
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，配备多种转染模块，可满足不同细胞类型、不同数量、不同通量的转染实验需求；
电转过程中配合使用不同细胞类型专用转染试剂，转染效率远高于传统电转仪；
采用由新型高分子聚合物制造的电极，相比传统铝制电转杯，杜绝金属离子毒害，细胞转染后成活率更高。
为提高细胞核转染效率，优化转染条件必不可少，相比其他品牌，LONZA可提供全球共享的数据库，可检索到700种以上的细胞转染数据和操作手册，除转染操作指导外，还提供细胞来源、传代、生长条件、培养基、转染后细胞培养基等各类技巧，大大节省摸索时间和试剂耗材损耗。
4D-Nucleofector细胞核转染平台，在小体积转染条件优化成功后，可不改变转染条件，直接用于大体积转染中，一次获得最多1*10^9数量的细胞，大大缩短实验时间。
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，由1个主机加不同模块构成，各模块可单独配置：
1.C模块（必选）：细胞核转染系统主机，即核心模块（Core unit），内置各类细胞转染程序。
2.X模块（可选）：最常选择的小体积转染模块，用于各类悬浮细胞转染。允许使用2个电极杯和1个中通量16孔电极板条。其中电极杯为100uL体系，适用于2*10^5至2*10^7数量细胞；16孔电极板条各孔为20uL体系，适用于2*10^4至1*10^6数量细胞，可同时转染16个样品。
3.Y模块（可选）：用于各类贴壁细胞的原位转染，无需消化细胞。允许使用1个24孔电极板，各孔为350uL体系，可同时转染24个样品。
4.LV模块（可选）：用于一种细胞的大规模连续转染。允许使用电转盘，其中小体积电转盘允许手动注射填充1mL，适用于1*10^7至1*10^8数量细胞；更大体积的电转盘允许以1mL体积不断进样，配合储液罐或储液袋，连续处理20mL体积，最高可转染10^9数量细胞。
5.96孔模块（可选）：用于高通量细胞转染，需要同时配置X模块。允许使用1个可拆卸的96孔电极板，由6个16孔电极板条组成，适用于2*10^4至1*10^6数量细胞，可同时转染96个样品，经常用于摸索转染条件。
相关文献
Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.(Curr Protoc Immunol,2019,124(1):e69)
Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.(Nature,2019,10(1):212)
CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.(Nat Protocols,2019,14(1):1-27)
Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.(J Med Genetics,2019,56:10-17)
Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells.(Nat Methods,2018,15(11))
Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.(Hum Gene Ther,2018)
Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.(J Exp Med,2018,215(3):985-997)
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统免费试用中，微信搜索“泽平科技”公众号进入咨询。
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