【评测】大鼠成骨细胞（OB细胞）的培养方法

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1）组织块法取大鼠成骨细胞：将新生SD大鼠(72h内)5只浸泡在体积分数75%乙醇烧杯中3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约1mm×1mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，加入含体积分数10%新生小牛血清的DMEM培养液终止消化，然后将碎骨片均匀接种于培养瓶中，翻转培养瓶置于培养箱中，3h后转正培养瓶。21d后换液，细胞长满瓶后传代培养。

2）胶原酶消化法：取新生SD大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM培养液配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液，再加入2.5mL消化液在37℃恒温条件下消化90min。用等量含血清培养液终止消化，将消化液转移至离心管中。用培养液将骨块洗3次，吹打骨块，同样转移液体到离心管中。离心1000r/min，6min沉淀细胞，含血清培养液重悬细胞，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养。差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

3）分段胶原酶消化法：取新生大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液。再加入2.5mL消化液。37℃恒温条件消化20min，收集细胞悬液，离心1000r/min，5min沉淀细胞，将上清转移至骨片继续消化重复6个循环。每次沉淀的细胞都要用含血清培养液重悬。最后将所有细胞悬液收集离心，含血清培养液重悬，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养，差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。

4）结果：酶消化分离所得细胞接种于培养瓶，24h后细胞充分伸展，呈梭形、三角形或不规则多边形。植块法细胞围绕骨片生长，细胞呈长梭型。培养2d后，胶原酶消化法获取的成骨细胞呈现多边形并有长突起，见图1；组织块法获取的成骨细胞呈现长梭状并有长突起，见图2。分离细胞皆有成骨细胞典型特征。