【总结】10 年细胞培养经验

一般进实验室都有师兄师姐带着做，他们的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则，如营养液、细胞瓶的摆放位置；灭菌处理程序；开盖手法；细胞吹打手法等等。

要学会他们的正确操作，在第一次的时候就要重视。我养细胞有 8 年了，今天就将我这几年来养细胞的经历和感想跟大家交流一下。

培养前的工作准备充分

包括耗材的处理、试剂的配置，无菌检验等等。

玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿（细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干净（注意死角），然后冲干净。

用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水冲洗 10 遍，除去残留酸液。瓶子之类，冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。

试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意 pH 值的调节。

无菌检验。主要采用过滤除菌：如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌：如 PBS、D-Hank's等。

试剂分装保存

包括营养液、胰酶、血清等。

血清特别重要。血清必须贮存于 –20℃，如果一次无法用完一瓶，可将 40～50ml 分装于无菌酸处理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。

一般厂商提供的血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。（一般情况下不影响细胞培养）瓶装血清一定要逐步解冻：4℃ 冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。

勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指 56℃，30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到 56℃后，将血清放入，待温度升高到 56℃ 后计时，一般 5 分钟左右规则摇晃均匀一次。

此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显着增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清（包括不同批次）对细胞的影响。

无菌意识要强

实验进行前，超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。

实验用品以 70% 乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。

小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

好细胞要及时保种

细胞要分批传代，这样即使有一批出了问题，还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。但这是我血的教训，有一次细胞污染了，全军覆没。当时可后悔没有保种。

每种细胞都有自己的特性，要区别对待。

细胞跟人一样，不同的细胞，培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。

如我养的平滑肌细胞很活跃，喜欢热闹，2~3 天就好多人口，而且不太爱吃喝，真是最好养的孩子了。内皮细胞和平滑肌细胞性格相近，不过它很不讲卫生，也很邋遢，里面有很多分泌物，要经常换洗才行。

RAW264.7 细胞也很开朗，而且很能吃，要经常喂它，头疼的是细胞很容易活化，培养它的瓶子和环境没有内毒素才好。

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