WB半定量内参有丢失解决方案

蛋白研究中，要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot，WB可对蛋白进行定性和半定量分析。我们天天都在做，但是半定量我们真的做对了吗？我们先来看看以下几个概念。

 

半定量

所谓的半定量，是将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果，是一个比值差异的统计学分析。

 

内部参照

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。

 

 

总蛋白提取

从培养的细胞/组织中提取全蛋白，也叫总蛋白，是蛋白质分析和纯化最常用的方法之一。理想的蛋白提取案应该能够从样品中提取所有蛋白质而不产生偏差。

然而，由于样品之间，蛋白质间之间都具有很大的差异，使得总蛋白提取时同时释放和溶解所有蛋白，变得极为困难。例如：蛋白质与膜整合或与其他蛋白质或核酸形成复合体时，都将极大阻碍蛋白提取的效率。因此，与体内情况相比，提取的蛋白质可能或多或少的失真。因此，内参的相对量也可能被改变。

 

 我们使用RIPA裂解液提取蛋白后通常产生RIPA可溶性组分和RIPA不可溶性组分，RIPA不可溶组分通常会被丢弃掉，扔掉的不可溶组分中有没有内参呢？我们的目的蛋白又有哪些变化呢？我们解析了如下文献：

 

Kevin A. Janes，2017，Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.

 

实验方法：

1.HT-29人结肠腺癌细胞使用RIPA裂解液裂解，RIPA不可溶组分使用Laemmli 样品缓冲液煮沸上样。

2.WB检测20种不同的抗体。

 

实验结果：

1. RIPA裂解液有效地溶解了许多细胞质蛋白和信号蛋白，如 GAPDH，Hsp90，IκBα等。

2.但Actin，tubulin，Lamin A和KRT5等蛋白在RIPA不可溶组分中大量丢失。

3. 值得注意的是：RIPA不可溶性组分不仅限于细胞骨架蛋白，转录因子GATA2和细胞粘附蛋白β-catenin也有丢失。

4.而和DNA紧密结合的蛋白质H3则完全存在于RIPA不可溶组分中。

 

2

Chandrani Mukhopadhyay，2016. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1615677113

实验方法：

1.野生型和CBL三重缺陷型原代小鼠乳腺上皮细胞分别使用RIPA提取蛋白，离心后的RIPA不可溶组分用SDS样品buffer直接溶解上样。

2.WB检测EGFR，HSP90，c-Src，Tubuin，pY-1068EGFR，pY-416c-Src。

 

实验结果：

1.Tubulin在RIPA不可溶组分中大量丢失。

2.有些蛋白（pY-1068EGFR）不存在于RIPA不可溶组分中，而有些蛋白（pY-416c-Src）则出现严重丢失，甚至不可溶性组分中信号比可溶性组分更强。

3.同一种蛋白（EGFR，HSP90，c-Src）在不同样品中丢失的情况并不相同。

 

同样的问题在SU YEON LEE和Eugene Khandros等人的研究中也出现了，Tubulin和Actin等常用内参在RIPA不可溶组分中大量丢失，如下图：

    SU YEON LEE，2010，

    DOI: 10.3892/or_00000830

       Eugene Khandros，2012，DOI1 0.1182/blood-2011-12-397729

 

总结

使用RIPA提取的总蛋白

1.并非是真正意义上的总蛋白，相当一部分蛋白丢失在弃去的不可溶组分中。

2.很多常用的内参，如Actin，tubulin，LaminA，H3等均在RIPA不可溶组分中被丢失。

3.目标蛋白可能会在RIPA不可溶组分中被丢失，也可能不被丢失，具有不可预见性，非选择性。

4.同种蛋白在不同样品中丢失的情况并不相同，蛋白丢失并不成比例。

5.利用目的蛋白和内参比值做校正会出现偏差，不适合WB目的蛋白的半定量分析。

 

样品制备时出现蛋白丢失的问题，真的是我们这么多年一直忽视的问题，特别是内参会丢失，目的蛋白可能丢，也可能不丢，这样的半定量结果是有偏差，不严谨的，所以要给与重视！

 

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