【整理】ELISPOT实验操作及常见问题

酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ，作为一项新型的免疫酶技术，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法敏感性高，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中。

原理：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

从字面上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫”与“斑点”。

	ELISA	ELISPOT
酶联免疫	抗体捕获的抗原来自样品溶液中的已经存在的、均匀分布的抗原分子	抗体捕获的抗原来自样品细胞在检测的当时新鲜分泌的抗原分子
酶联免疫斑点	显色出来的是或深或浅的有色溶液	显色出来的是沉积在固体基板上或多或少的有色斑点

一言以蔽之，ELISA 检测的是无生命的溶液中抗原分子的浓度，ELISPOT 检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原的功能。

工作原理：

A.特异性单抗包被在培养孔底部；

B.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被抗体捕获；

C.移出细胞，板底留下自胞因子的潜在“影像”；

D.加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细

胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构；

E.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；

F.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。

ELISPOT的优势：

常见问题小结：

1、酒精预湿时要恰当

PVDF膜由于其疏水性，需要酒精预湿润，但是预湿的时间太长和太短都不合适。一般情况下，预湿的时间控制在30秒。

2、洗涤PVDF膜次数和时间

每孔加入 200μl 洗涤液，洗涤 5 次以上，每次浸泡时间约30秒。

3、细胞和刺激物的浓度

细胞浓度通常为2～5×105cells/well，刺激物浓度10～50ug/mL，依据实际情况摸索形成最适密度的单细胞层分泌合适的斑点数。

3、包被抗体的量

包被抗体的质量和浓度与斑点的大小形态很有关系，如下图，随着包被抗体浓度的增加斑点变得清晰致密。

3、细胞、刺激物加样

先加刺激物（悬空滴加），然后悬在孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避免了贴壁细胞产生。

注意：一定不要拍击板子来让细胞混匀，那样会适得其反。

6、细胞的培养

7、斑点的出现空斑

主要原因：粒细胞分泌或分解所致的酶解现象。

可以通过采用多价刺激物，以及提高PBMC的分离质量来改善。

7、显色时机的把握

显色时间一般控制在2～10分钟，要依斑点的形成情况适时终止显色。

显色反应和温度有很大的关系，如果室温很低（如冬季），可以适当延长显色的时间。

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