基于CRISPR等基因组编辑技术的“非转基因类”农作物改造

作为农业研究领域中社会热度较高的话题，转基因作物早已进入大众视野，并且引起了一系列争议。面对转基因技术争议和农作物增产增质需求之间的矛盾，如何在改造植物性状的同时消除外源基因插入的影响是科学家们需要解决的重要问题。所以，近年来基于CRISPR等基因组编辑技术的“非转基因类”农作物改造已成为研究热点之一。在这样的背景下，IDT埃德特公司携手美国马里兰大学与南京农业大学，对于“非转基因类”植物基因组编辑技术进行了深入的方法学研究，优化了反应条件，并证明了采用RNP递送法进行植物原生质体CRISPR-Cas12a基因组编辑的高效性。

此研究发表于Frontiers in Genome Editing期刊，该期刊是瑞士Frontiers出版社旗下的一份新创开放型期刊，致力于介绍基因组和表观基因组编辑技术的进展，挖掘其在研究和临床转化中的意义，从而推动前沿研究，并向业界传播有影响力的科学发现。Frontiers出版社拥有超过10万名顶尖研究人员组成的编辑委员会，涵盖900多个学科，出版有46份SCI期刊，是世界上最大、引用率最高的出版商之一。

研究简介

在CRISPR基因组编辑实验中，核糖核蛋白（RNP）递送策略可以防止外源性DNA整合，最大限度地减少脱靶效应，能避免传统质粒转染递送法存在的的风险的同时，也可以降低细胞毒性。然而，尽管RNP递送CRISPR进行基因组编辑的优势已在许多植物物种中得到证实，但其优化策略却尚未得到彻底研究。为此，研究者们对农作物RNP递送CRISPR进行了全面的方法学优化策略研究，聚焦于在植物原生质体基因组编辑中，比较不同的Cas12a核酸酶、温度、剂量、Cas12a:crRNA比例、crRNA修饰以及核定位信号（NLS）对于编辑效率的影响。

在研究中，研究人员使用了植物基因编辑常用的CRISPR-Cas12a（或称Cpf1）作为编辑系统，利用水稻和柑橘原生质体系统作为实验样本，探究了如何以RNP形式递送Cas12a才能获得高效可靠的基因组编辑结果。他们共研究了四种Cas12a变体，包括LbCas12a、LbCas12a-E795L、AsCas12a和AsCas12a Ultra（研究中使用的所有Cas12a变体产品及定制的crRNA均由IDT埃德特生产提供）。通过限制性片段长度多态性（RFLP）检测，LbCas12a、LbCas12a-E795L和AsCas12a Ultra在四个目标位点中均观察到近100%的编辑效率，这一结果也通过基于多重PCR扩增子的下一代测序（NGS）技术进行了验证。

研究结论

• 在32°C和25°C条件下，各位点编辑效率接近100%（图1），且RNP递送比质粒递送具有更高的编辑效率（图2）。

图1. 生物工程Cas12a变体通过RNP递送至水稻细胞中表现出更强的活性。图中显示了OsPDS（A）、OsROC5（B）、OsmiR528（C）和OsEPFL9（D）四个编辑位点，在32℃条件下通过四种Cas12a变体的编辑效率都接近100%。编辑效率通过RFLP分析计算。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。使用HSD检验法，比较了每个目标位点的四种Cas12a变体的编辑效率。当α=0.05时，相同编辑位点的不同处理方式处理没有显著差异。

图2. 比较了使用RNP和质粒两种递送方式进行Cas12a基因组编辑的效率。分别在32℃和25℃条件下，在水稻细胞中对OsEPFL9位点使用三种Cas12a变体进行了编辑。（A）DNA凝胶电泳显示的RFLP评估了目标位点的编辑效率。（B） 基于RFLP分析编辑频率的量化数据比较。（C） 通过扩增子深度测序对编辑频率进行量化比较。（B，C）使用HSD检验法，比较了三种Cas12a变体在相同温度下使用相同递送方法的编辑效率。当α=0.05时，相同编辑位点不同Cas12a变体间没有显著差异。使用t检验比较不同温度下的编辑效率，并用一个星号（p<0.05）、两个星号（p<0.01）或三个星号（p<0.001）表示差异显著性。（D）在水稻细胞中，32℃和25℃条件下RNP递送和质粒递送的OsEPFL9编辑位点图谱，各使用了三种Cas12a变体。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。在（B，C，D）三图中，RNP递送均表现出比质粒递送更高的编辑效率。

• 与AsCas12a和AsCas12a-E795L相比，LbCas12a和LbCas12a-E795L表现出更高的编辑效率，尤其是在RNP浓度较低时（图3）。

图3.  不同剂量的Cas12a在RNP递送的水稻细胞中的编辑效率。在32°C条件下，在OsEPFL9位点进行RNP递送的水稻细胞中测试了四种Cas12a变体的编辑效率。编辑效率使用高RNP浓度（A，B）和低RNP浓度（C）的RFLP分析进行计算。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。（A，B，C）三图的比较中，LbCas12a和LbCas12a-E795L均表现出更高的编辑效率，在低于0.01μM的低RNP浓度条件下差异更明显。

• 1:1的Cas12a:crRNA摩尔比例足以实现有效的基因组编辑（图4）。

图4.  在不同Cas12a:crRNA摩尔比例下，RNP向水稻细胞中递送的Cas12a编辑效率。在32°C条件下，测试了两种Cas12a变体对OsEPFL9位点的编辑效率。编辑效率是使用RFLP分析法计算，三种RNP浓度分别为0.1μM（A）、0.01μM（B）和0.001μM（C）。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。使用HSD检验法，比较了四种不同Cas12a:crRNA摩尔比例下的编辑效率差异。当α=0.05时，相同处理条件下不同Cas12a:crRNA摩尔比例没有显著差异。

• 核定位信号（NLS）对于基于RNP的高效基因组编辑至关重要（图5）。

图5. Cas12a利用不同核定位信号（NLS）在RNP递送水稻细胞中的编辑效率。在32°C条件下，在两个靶点的RNP递送水稻细胞中测试了含不同NLS的Cas12a-E795L的编辑效率。使用RFLP分析，在OsROC5（A，B）和OsEPFL9（C，D）编辑位点的两种RNP浓度（0.01和0.001μM）下计算编辑效率。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。使用HSD检验法比较了不含或含有不同类型NLS的Cas12a核酸酶的编辑效率。当α=0.05时，存在NLS的相同处理组间没有显著差异，而缺失NLS信号的实验组编辑效率显著低于其他组。

• 将Cas12a RNP系统应用于柑橘原生质体，并在目标位点获得了与水稻类似的高编辑效率（图6）。

图6.  使用RNP递送LbCas12a以在柑橘细胞中进行基因编辑。（A） 从哈姆林89甜橙胚性细胞系中生产原生质体的工作管线。（B） 使用RFLP分析计算的LbCas12a编辑效率，在28°C条件下，基因CsPH5使用三种RNP递送浓度进行编辑，浓度分别为0.1、0.01和0.001μM。（B）左图显示为RFLP分析图谱，（B）右图显示基于RFLP分析的量化编辑效率鉴定。数据以三个生物学独立重复的平均值±SEM表示。

该研究为Cas12a介导的农作物基因组编辑提供了一个全面的指导方案，利用RNP在植物细胞中的递送，研究者们为开发“非转基因类”植物高效编辑技术奠定了基础。同时，IDT埃德特的基因组编辑产品也在本次研究中表现出了令人满意且可靠的实验效果。民以食为天，可以预见，基因组编辑技术在农业领域的应用，将来会为改善大众生活发挥更大的作用，IDT埃德特也将持续在基因组编辑领域中提供支持，为科学家们造福人类的伟大事业贡献力量。

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